近年来,微生物电化学系统（Microbial electrochemical system,MES）是能源与环境领域的研究热点。产电菌可以充当MES阳极生物催化剂,氧化有机底物,并通过电子传递系统,将电子传递到电极。阳极产电菌的胞外电子传递（EET）是MES的关键步骤。目前关于EET的研究中,Shewanella oneidensis MR-1是被研究最多的模式生物之一。MR-1的EET有多种可能的模式,包括通过细胞与固体电极的直接接触、生物膜氧化还原蛋白间电子交换介导的长程EET以及扩散性电子穿梭。然而,这些模式对产电的实际贡献还不完全清楚。MR-1的基因组编码了42种不同的细胞色素c,这些细胞色素c在MR-1的EET过程中起了重要作用。特别是Cym A与外膜蛋白复合体MtrCAB-Omc A组成的Mtr电子传递通路被证明在铁氧化物与电极的还原中起到了关键性作用。尽管这些蛋白的理化性质得到了大量研究,也有一些研究者敲除了相关蛋白并探讨其对于细菌胞外电子传递的影响;但是这些蛋白在电子传递、细胞附着电子受体、结合电子穿梭体中所扮演的具体角色还不完全明确。因其快速简便的特点,电化学方法在微生物胞外电子传递机理研究中得到了广泛应用。但单纯的电化学研究无法提供关于电极生物膜形成过程的实时信息,无法掌握细菌与电极相互作用的真实情况。本研究将生物电化学反应器置于荧光显微镜的观察台上,通过高倍物镜实时观察附着于反应器底部透光氧化铟锡（Indium tin oxide,ITO）玻璃电极表面的S.oneidensis生物膜。此荧光显微-电化学联用实验可以反映电极生物膜发展（厚度、在电极表面的覆盖度）与细菌产电和电化学行为之间的关联性。这可以帮助我们理解希瓦氏菌产电的主要模式。研究中也通过这一技术来了解一些重要细胞色素c的缺失对细菌形成电极生物膜和产电行为的影响。主要结论包括:MR-1进行产电需要细胞与电极之间的直接接触,但是悬浮细胞接触电极之后,不能立刻开始产电,需要经历一个滞后期才开始分泌产电相关的氧化还原蛋白,细胞需要更长的时间才能达到较高产电能力。实验中将标记了绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein,GFP）的MR-1接入与荧光显微联用的单室三电极反应器中。接种后可立即看到电极表面8.6%的面积被细菌附着。载入计时电流,在0.4 V的恒定电位下培养,此时立刻记录到0.71±0.23μA cm-2（n=3,后同）的电流密度。随培养时间推移,2.6 h后电流水平增加到1.85±0.32μA cm-2,而此时电极表面细菌覆盖度已迅速增长至46%左右（由于相邻细胞之间存在间隔,当电极上长满了细菌时,ITO表面的细菌覆盖率也仅高于50%,而非100%）。其后电流持续增长,但是在15 h后电流增长速度放缓,25 h时电流水平达到6.51±0.24μA cm-2,而此时电极表面覆盖度为53%。此时在生物膜厚度方向上以2μm的间隔拍摄一张显微图片,利用Image J软件进行三维重建。发现此时的生物膜为多层,厚度约为6μm。在培养中不同时期记录了方波伏安（Square wave voltammetry,SWV）曲线,在细菌刚接入反应器时,伏安图中可见两个氧化还原电对;其中一对其中点电位为-0.145 V,另一对中点电位在0.16 V。此两个氧化还原峰的位置很快移动到-0.1 V和0.17 V,并且峰高度均随着时间增加。产电过程中峰高度增长速度快于产电水平的增加,慢于电极表面细菌覆盖度的增加。溶液中的悬浮细菌与多层电极生物膜中未与电极直接接触的细菌对产电水平贡献很小,去除这些细菌对体系的电化学行为几乎没有影响。对接种MR-1的反应器载入计时电流,并在0.4 V恒定电位下培养约29.3 h后,反应器产电水平到趋于稳定,此时产电水平约为7.17μA cm-2。用注射器抽取反应器溶液,并洗涤反应器内部,将去除浮游细菌后的电解液重新返回反应器。显微镜观察表明,经过此操作后,电极生物膜变为单层,未与电极直接接触的细菌被洗去。恢复计时电流法后,在1.5小时内,电流水平迅速恢复到约6.87μA cm-2,相当于抽取培养液前的95.8%。且SWV曲线与操作前没有明显差异。尽管溶液中检出游离的黄素,但是这些黄素介导的远距离电子传递机制在产电中的作用可能非常有限。敲除mtrC、omcA或cymA基因后,MR-1的产电能力均下降,ΔomcA、ΔcymA产电水平尤为低下。对接种以上三种变异菌的反应器载入计时电流,在0.4 V的恒定电位下培养。此时接种ΔmtrC的反应器立刻记录到0.1±0.03μAcm-2的电流密度;接种ΔomcA的反应器立刻记录到0.03±0.01μA cm-2的电流密度;接种ΔcymA的反应器立刻记录到0.01±0.015μA cm-2的电流密度。在计时电流运行25 h时,ΔmtrC电流密度为1.17±0.04μA cm-2,相当于同期野生菌产电能力的18%;ΔomcA电流密度为0.21±0.005μA cm-2,相当于同期野生菌产电能力的3%;ΔcymA电流密度为0.27±0.004μA cm-2,相当于同期野生菌产电能力的4%。缺失MtrC蛋白不会明显影响细菌与电极表面结合的能力;缺失Omc A或Cym A会降低MR-1与电极表面结合的能力。反应器接种ΔmtrC菌株后可立即看到28%左右的电极表面被细菌覆盖;接种ΔomcA菌株后可立即看到13%左右的电极表面被细菌覆盖;接种ΔcymA菌株后可立即看到8%左右的电极表面被细菌覆盖。经历25 h的产电之后,接种ΔmtrC的反应器工作电极表面细菌覆盖度约为45%,接近于同期野生菌的电极表面细菌覆盖度;接种ΔomcA的反应器工作电极表面细菌覆盖度约为30%;接种ΔcymA的反应器工作电极表面细菌覆盖度约为25%。ΔmtrC、ΔomcA、ΔcymA产电能力的下降是MtrCAB电子传递能力受到破坏所致。在接种了ΔmtrC的反应器产电过程中,通过SWV可以看到中点电位位于0.17 V附近细胞色素c的电化学信号,以及中点电位位于-0.13 V附近的黄素自由基的电化学信号。对比SWV峰高度与细菌产电水平之间的关系,以黄素介导的间接电子传递是ΔmtrC的主要产电机制。相比野生菌,黄素的电位向负移,因此说明了细胞色素与黄素的结合能力也有所降低。在接种ΔomcA或ΔcymA的反应器产电过程中,通过SWV可以看到中点电位位于0.17 V附近细胞色素c的电化学信号,以及中点电位位于-0.17 V附近的黄素自由基的电化学信号。低电位-0.17 V的峰电流与产电水平存在一定的正相关,高电位0.17 V的峰电流与产电水平无明显相关性。并且高电位的峰电流在产电过程中处于下降趋势,这说明0.17 V附近所代表的细胞色素c介导的直接电子传递并不是细菌产电的主要途径,以黄素介导的间接电子传递是ΔomcA以及ΔcymA的主要产电机制。相比野生菌,黄素的电位进一步向负移,这表明细胞色素与黄素的结合能力微弱。对电流增长至平台期的敲除相应细胞色素c的反应器进行换水重新载入计时电流,并且对比前后伏安图线。ΔmtrC换水之后黄素自由基所在的电位（-0.17V附近）阳极峰高度下降约60%;ΔomcA换水之后黄素自由基所在的电位（-0.17V附近）左移,阳极峰高度下降约72%;ΔcymA换水之后黄素自由基所在的电位（-0.17V附近）消失,在-0.25 V附近出现了一对未知的氧化还原峰。进一步说明敲除MtrC、Omc A或Cym A蛋白会影响黄素与细胞色素c结合的能力。