近年来,自噬所涉及的疾病种类日益繁多,已然成为了生物医学领域的研究热点,研究范围不断地拓展,研究的层次日渐加深。研究表明,在某些疾病的发病机制中,自噬起着关键作用。自噬水平的改变与抑郁症、慢性应激损伤之间具有非常紧密的联系,研究关注点主要集中在自噬对神经元的影响上。抑郁症机制复杂,研究自噬与抑郁症的关系意义重大。许多抗抑郁药参与调控自噬的活性,影响自噬信号通路,使得自噬可能成为抑郁症一种潜在的药理学研究热点。自噬功能失调与神经发生障碍和神经可塑性失调密切相关。体内多条信号转导通路对自噬的活性均有调控作用,但mTORC1(mammalian target of rapamycin complex 1)信号转导通路是自噬研究中最为重要的调控通路之一。目前已有研究表明,mTORC1信号通路的激活是药物抗抑郁作用的必要条件,很多传统的抗抑郁药都对mTORC1通路有调节作用。因此,靶向调节mTORC1信号传导通路可以作为抗抑郁治疗的研究方向。目前关于自噬对神经元影响的研究报道具有两面性,自噬的活化对神经系统起保护作用还是加剧神经元的损伤尚存在一定的争议。目的:本研究旨在观察调肝方药四逆散对慢性不可预知缓和应激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)抑郁模型大鼠海马神经元自噬活性及mTORC1信号转导通路的影响,以期探讨调肝治法抗抑郁作用的机理,论证“肝主疏泄”功能与细胞自噬功能的关系,为“肝主疏泄”生物学内涵的阐释和发挥提供新角度。方法:1.造模:研究对象选用Wistar雄性健康成年(6周龄)大鼠,总数为75只,按入组前1天的初始体质量值随机分配至空白组、模型组、补肾方组、调肝方组、健脾方组,每组15只,除空白组大鼠外,其余4组大鼠均接受为期42d的慢性不可预知缓和应激,应激内容主要包含7个项目,分别为禁食禁水(24h)、热烘(40℃-50℃)、冰泳(6℃-4℃)、电击(35V-55V)、夹尾(3min-6min)、束缚(4h-6h)、频闪(2h-12h),第1周每日给予1种应激,第2周每日给予1-2种应激,逐渐过渡到每日给予2种应激,每天随机安排应激项目,同种应激不得连续2天内出现,连续42d,建立慢性不可预知缓和应激抑郁模型。2.药物干预措施:补肾方组、调肝方组、健脾方组大鼠分别于应激前给与右归丸、四逆散、四君子药液灌胃来进行药物干预,其余2组予纯水灌胃作对照,连续干预42d。3.评价指标:(1)躯体症状指标:体质量。(2)行为学指标:选用旷场实验(评价大鼠自主活动)、糖水偏好实验(反映大鼠快感缺失与否)、Morris水迷宫实验(评价学习记忆能力)对各组大鼠行为学进行评价。(3)生物学指标:酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测各组大鼠脑脊液中脑源性神经营养因子(BDNF)、5-羟色胺(5-HT)含量及血清中促肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质醇(CORT)含量;HE染色法、Nissl染色法观察各组大鼠海马CA3区神经元形态结构及尼氏小体情况;免疫荧光技术观察各组大鼠海马CA3区自噬相关蛋白LC3表达情况;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western Blot)技术检测各组大鼠海马中自噬及mTORC1信号传导通路相关基因及蛋白的表达。结果:1.体质量入组前即CUMS造模前,各组大鼠体质量组间无统计学意义上的差别,经过42d的应激造模后,模型组大鼠体质量增长幅度远不及正常组(P<0.01);补肾方组、调肝方组、健脾方组大鼠的体质量增长幅度与模型组大致相当。2.行为学CUMS造模后,糖水偏好率结果显示,模型组大鼠糖水偏好率远远低于空白组大鼠(P<0.01);药物干预组中,仅调肝方组大鼠的糖水偏好率较模型组升高(P<0.05),而补肾方组、健脾方组大鼠的糖水偏好率从数值上来看虽较模型组大鼠的糖水偏好率也有所增加,但组间差异均无统计学意义。CUMS造模后,旷场水平运动总路程的的结果显示:模型组大鼠旷场水平运动总路程较空白组大鼠显著缩减(P<0.01);补肾方组、调肝方组、健脾方组大鼠的旷场水平运动总路程均较模型组大鼠显著延长(P<0.01)。CUMS造模后,Morris水迷宫定位航行实验结果显示:时间和分组因素存在交互作用,且时间因素的作用因分组的不同而不同,但每天各组大鼠逃避潜伏期组间比较无统计学差异;Morris水迷宫空间探索实验结果显示:模型组大鼠穿越平台次数较空白组大鼠显著减少,目标象限路程及目标象限停留时间较空白组大鼠显著缩短(P<0.01);药物干预组中,仅补肾方组大鼠的目标象限路程及目标象限停留时间较模型组大鼠有所增加(P<0.05),虽然调肝方组、健脾方组大鼠的穿越平台次数、目标象限路程、目标象限停留时间和模型组相比均呈现增加的趋势,但组间差异均无统计学意义。3.大鼠脑脊液中的BDNF、5-HT含量比较CUMS造模后,模型组大鼠脑脊液中的BDNF、5-HT含量均较空白组大鼠显著减少(均P<0.01);补肾方组、调肝方组、健脾方组大鼠经不同方药干预后均能有效逆转模型大鼠脑脊液中BDNF含量减少的情况(均P<0.01),除补肾方组外,其余2组大鼠脑脊液中的5-HT含量较模型组有不同程度的增加(P<0.05或P<0.01)。与调肝方组相比,健脾方组大鼠脑脊液中的BDNF含量减少,补肾方组大鼠脑脊液中的5-HT含量减少(P<0.05或P<0.01)。4.大鼠血清中的ACTH、CORT含量比较CUMS造模后,模型组大鼠血清中的ACTH、CORT含量均较空白组大鼠显著增多(均P<0.01);药物干预组中,仅调肝方组大鼠经方药干预后能同时降低模型大鼠血清中ACTH、CORT含量水平(P<0.05或P<0.01),健脾方组大鼠经方药干预后仅能降低模型大鼠血清中C0RT含量水平(P<0.01),而补肾方组大鼠血清中的ACTH、CORT含量未见明显改善。补肾方组、健脾方组大鼠血清中的ACTH、CORT含量和调肝方组相比,组间差异均无统计学意义。5.大鼠海马CA3区神经元形态结构及尼氏小体分布情况空白组大鼠海马CA3区细胞密度大,锥体细胞层厚,神经元结构形态正常,胞浆内尼氏小体深染,数量丰富。模型组大鼠海马CA3区神经元出现明显病理变化,主要表现为细胞密度变小,神经元数量较空白组大鼠明显减少,锥体细胞间隙增大,神经元结构模糊,形态不规则,排列疏松紊乱,胞浆尼氏小体浅染或消失。和模型组相比,各方药干预组均可不同程度改善模型大鼠海马CA3区神经元的损伤。6.大鼠海马CA3区神经元LC3免疫荧光结果对比空白组大鼠海马CA3区神经元中存在少量较暗LC3绿色荧光点;模型组海马CA3区神经元LC3免疫荧光亮度较空白组明显增高,绿色荧光点增多;与模型组相比,补肾方组、调肝方组、健脾方组大鼠海马CA3区神经元内LC3绿色荧光表达均有不同程度的下降,其中调肝方组大鼠海马CA3区LC3绿色荧光亮度相对较暗,补肾方组和健脾方组亮度大致相当。7.大鼠海马组织中自噬及中mTORC1信号通路关键基因的表达比较和空白组相比,模型组大鼠海马组织中自噬相关基因LC3 mRNA相对表达水平上升,p62 mRNA相对表达水平显著下降(均P<0.01)。除补肾方组外,调肝方组、健脾方组大鼠海马组织中自噬相关基因LC3 mRNA相对表达水平较模型组大鼠下降,p62 mRNA相对表达水平较模型组大鼠上升(均P<0.01)。和调肝方组相比,补肾方组大鼠海马组织中LC3 mRNA相对表达水平升高,p62 mRNA相对表达水平降低(均P<0.01),健脾方组仅p62 mRNA相对表达水平低于调肝方组(P<0.01)。和空白组相比,模型组大鼠海马组织中mTORC1信号通路关键基因PI3K mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA、Raptor mRNA相对表达水平均下降(P<0.05或P<0.01)。和模型组相比,只有调肝方组大鼠海马组织中PI3K mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA、Raptor mRNA相对表达水平全部上调(均P<0.01);补肾方组大鼠海马组织中仅mTOR mRNA、Raptor mRNA相对表达水平上调(均P<0.01);健脾方组大鼠仅mTOR mRNA相对表达水平上调(P<0.05)。和调肝方组相比,补肾方组、健脾方组大鼠海马组织中PI3K mRNA、Akt mRNA、Raptor mRNA相对表达水平均降低(均P<0.01),健脾方组大鼠海马组织中mTOR mRNA相对表达水平下调(P<0.01)。8.大鼠海马组织中自噬及中mTORC1信号通路相关蛋白的表达比较与空白组比较,模型组大鼠海马组织中蛋白p62相对表达水平明显下调,蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著升高(均P<0.01)。和模型组相比,补肾方组、调肝方组、健脾方组大鼠海马组织中蛋白p62相对表达水平均上调,蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均下降(均P<0.01)。和调肝方组相比,补肾方组、健脾方组大鼠海马组织中蛋白p62相对表达水平均下降,蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均增大(P<0.05或P<0.01)。与空白组比较,模型组大鼠海马组织中蛋白p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR的比值,蛋白Raptor相对表达水平均呈现不同程度的下调(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,调肝方组大鼠海马组织中蛋白p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR的比值,蛋白Raptor相对表达水平均升高(均P<0.01);补肾方组大鼠海马组织中仅p-PI3K/PI3K 比值较模型组增加(P<0.01);健脾方组大鼠海马组织中仅p-PI3K/PI3K及p-mTOR/mTOR的比值较模型组增加(均P<0.01)。和调肝方组相比,补肾方组、健脾方组海马组织中蛋白p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR的比值,蛋白Raptor相对表达水平均降低(均P<0.01)。与空白组比较,模型组海马组织中蛋白p-p70S6K/p70S6K、p-4EBP1/4EBP1的比值均显著下调(均P<0.01)。与模型组比较,调肝方组、健脾方组大鼠海马组织中p-p70S6K/p70S6K、p-4EBP1/4EBP1 的比值均不同程度升高(P<0.05 或P<0.01),补肾方组大鼠海马组织中仅p-4EBP1/4EBP1的比值较模型组有所增加(P<0.05)。和调肝方组相比,补肾方组、健脾方组大鼠海马组织中蛋白p-p70S6K/p70S6K、p-4EBP1/4EBP1的比值均不同程度下调(P<0.05或P<0.01)。结论:1.42天的CUMS抑郁模型大鼠脑脊液中BDNF、5-HT和血清中ACTH、CORT异常表达,海马PI3K/Akt/mTORC1信号通路活性下调,自噬过度激活并引起海马神经元损伤,从而导致抑郁样行为学改变。2.经3种不同治法方药的药效反证,调肝方四逆散抗抑郁作用总体优于补肾方右归丸和健脾方四君子,但未能有效改善大鼠的体质量及学习记忆能力,提示42天的CUMS抑郁模型大鼠证候以“肝郁”为主,同时兼有“肝郁脾虚”、“肝郁肾虚”,中医证候呈现出“因郁致虚,虚郁兼夹”的动态变化过程。3.四逆散抗抑郁效应机制可能与其升高大鼠脑脊液中BDNF、5-HT含量,降低血清中ACTH、CORT含量,激活海马PI3K/Akt/mTORC1信号通路级联反应来抑制过度自噬,从而缓解海马神经元损伤有关。4.细胞自噬功能失调可能是“肝失疏泄”的微观病理基础之一,而“肝主疏泄”的生物学内涵可能与其介导mTORC1信号通路对自噬功能进行调控相关。