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第一部分血糖波动对糖尿病大鼠肾损伤的作用及其机制目的:1.研究血糖波动对糖尿病大鼠肾功能和肾脏组织病理学的影响,探讨血糖波动对糖尿病大鼠肾损伤的作用;2.研究血糖波动对糖尿病大鼠肾组织氧化应激和AKT信号通路的影响,探讨血糖波动加重糖尿病大鼠肾损伤的机制。方法:54只雄性SD大鼠随机分为3组:正常对照组(CON组,n=18)、糖尿病组(DM组,n=18只)和血糖波动组(FDM组,n=18只)。CON组的大鼠常规喂养正常饲料,DM和FDM组的大鼠喂养高糖高脂饲料,均保证饮水充足。实验第4周,DM和FDM组的大鼠一次性给予腹腔皮下注射链脲佐菌素35mg/kg以建立2型糖尿病大鼠模型,72h后,大鼠尾静脉采血测随机血糖>16.7mmol/l且稳定者视为模型建立成功。造模成功后,FDM组大鼠每天定时予短效胰岛素腹部皮下注射(20U/kg,06:00,12:00,18:00),并错时予注射葡萄糖(3g/kg,9:00,15:00,21:00),造成一天中血糖浓度大幅度波动模型,CON组及DM组给予等量生理盐水对照。实验期间每4周测定大鼠体重,并检测大鼠血糖2天,每天6次(6:30,9:30,12:30,15:30,18:30,21:30),计算血糖变异系数(CV)、血糖日平均水平(MBG)、最大血糖波动幅度(LAGE)和日平均血糖的标准差(SDBG);实验第16周开始收集24h尿液标本测测定各组大鼠24h尿白蛋白定量,收集血液,测定尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、血脂(TC、TG、LDL和HDL-C)、糖化血红蛋白(Hb A1c);肾皮质丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量,肾皮质总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)活性。透射电镜观察大鼠肾脏组织形态;Western blot法检测各组大鼠肾脏AKT、p-AKT(Ser473)、GSK-3β、p-GSK-3β(Ser9)和Cleaved Caspase-3的蛋白表达及NF-κB的活力情况。结果:1.实验第四周,与CON组比较,DM组和FDM组体重增加,差异有统计学意义(P<0.05);实验第12周和16周,与CON组比较,DM组和FDM组体重下降,差异有统计学意义(P<0.05)。2.生化指标显示:与CON组比较,DM组和FDM组Hb A1c水平显著增高,差异具有统计学意义(P<0.05),DM组Hb A1c水平较FDM组无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05);与CON组比较,DM组CV、MBG、SDBG和LAGE明显增加,FDM组较DM组显著增高,差异有统计学意义(P<0.05)。DM组的大鼠24h尿白蛋白定量、BUN、Scr较CON组明显增高,差异有统计学意义(P<0.05),FDM组24h尿白蛋白定量较DM组进一步增高,差异有统计学意义(P<0.05),BUN、Scr水平无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。与CON组比较,DM和FDM组大鼠TC、TG、LDL均升高,HDL-C降低,差异有统计学意义(P<0.05),但DM组TC、TG、LDL和HDL-C与FDM组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。3.电镜下,与CON组相比,DM组大鼠的肾组织中的肾小球基底膜(GMB)增厚,足突宽度增加;与DM组相比,FDM组的上述病理学改变更明显,差异有统计学意义(P<0.05)。4.氧化应激:与CON组相比,DM组T-SOD活性降低,MDA水平增加;与DM组相比,FDM组T-SOD活性降低及MDA水平增加更明显(P<0.05)。5.蛋白印迹法结果显示:与CON组比较,DM组p-AKT表达减少,肾组织中p-GSK-3β和Cleaved Caspase-3蛋白及NF-κB活力增加,FDM组较DM组p-AKT表达被明显抑制,而p-GSK-3β和Cleaved Caspase-3蛋白及NF-κB活力进一步增加(P<0.05)。结论1.血糖波动加重糖尿病大鼠肾结构及功能损害;2.血糖波动加重糖尿病大鼠肾损伤可能与增加肾组织中氧化应激和抑制AKT信号通路相关。第二部分血糖波动对肾小球系膜细胞的影响及相关机制研究目的:1.研究血糖波动对肾小球系膜细胞损伤的影响;2.研究血糖波动对肾小球系膜细胞中氧化应激和AKT信号通路的影响,探讨血糖波动加重系膜细胞损伤的机制;方法:1.肾小球系膜细胞购自武汉博士德公司,使用含10%胎牛血清的低糖DMEM在37℃5%CO2培养箱中进行传代培养。选取5-10代的细胞进行实验。实验分为4组:低糖组(NG组):肾小球系膜细胞在5.6mmol/L葡萄糖的DMEM低糖培养基中培养。高糖组(HG组):肾小球系膜细胞在25mmol/L葡萄糖的DMEM高糖培养基中培养。波动血糖组(FG组):细胞用25 mmol/L葡萄糖的DMEM高糖培养基和5.6mmol/L葡萄糖的DMEM低糖培养基每隔3小时交替换液培养,每天重复3次,然后将细胞置于5.6 mmol/L葡萄糖的DMEM低糖培养基中培养过夜。高渗组(MG组):取甘露醇加入5.6 mmol/L葡萄糖的DMEM低糖培养基中使甘露醇含量为20mmol/L作为渗透压对照。分别于分组培养12h,24h,48h,72h用CCK8试剂盒检测细胞活力,同时检测细胞氧化应激水平为后续实验选择合适的时间点。时间点(48h)确定后,实验增加血糖波动+AKT特异性激动剂组,即:血糖波动+IGF-1组(FG+IGF组,先用25ng/m L的IGF-1组预处理细胞30min,后续实验同血糖波动组)和血糖波动+胰岛素组(FG+RI组,先用100nmol/L的胰岛素预处理细胞30min,后续实验同血糖波动组)。分别检测各组细胞活性氧含量、细胞凋亡率、AKT、p-AKT(Ser473)、GSK-3β、p-GSK-3β(Ser9)、Cleaved Caspase-3蛋白的表达及NF-κB的活化。结果:1.CCK8结果显示,与NG组相比,12h时HG组和FG组肾小球系膜细胞增殖率增加(P<0.05),HG组和FG组比较,肾小球系膜细胞增殖率无明显组间差异(P>0.05),后续实验将该时间点排除。与NG组相比,24h时HG组和FG组肾小球系膜细胞增殖率增加(P<0.05),HG组和FG组比较,肾小球系膜细胞增殖率无明显组间差异(P>0.05),NG和MG组之间差异无统计学意义。48h和72h时,与NG组相比,HG组和FG组肾小球系膜细胞增殖率降低(P<0.05),且FG组较HG组肾小球系膜细胞增殖率降低更加明显(P<0.05);但MG组肾小球系膜细胞内在72h时也出现细胞增殖降低。为了选择哪个时间点细胞凋亡更明显,后续实验再次筛选24h和48h这两个时间点。2.24h时,与NG组相比,HG组和FG组肾小球系膜细胞内的SOD活性下降,MDA水平含量上升(P<0.05);与HG组相比,FG组肾小球系膜细胞内的SOD活力下降及MDA水平含量上升程度更加明显(P<0.05);48h时,血糖波动使肾小球系膜细胞内SOD活性降低,MDA水平含量更加显著。因此选择48h中作为后续实验时间点。3.活性氧簇(ROS)检测:48h时,与NG组相比,HG组与FG组肾小球系膜细胞内ROS水平是显著增高(P<0.05);与HG组比较,FG组肾小球系膜细胞内ROS水平升高更为明显(P<0.01);而加入AKT激动剂后,FG+IGF组、FG+RI组较FG组ROS水平降低(P<0.05)。4.流式细胞术检测细胞凋亡结果显示:与NG组相比,HG组与FG组肾小球系膜细胞的凋亡细胞明显增加(P<0.05);与HG组比较,FG组肾小球系膜细胞的凋亡细胞增加更为明显(P<0.05);而加入AKT激动剂后,FG+IGF组、FG+RI组较FG组相比,凋亡细胞明显减少(P<0.05)。5.Western blotting法结果显示:与NG组相比较,HG组肾小球系膜细胞中p-AKT表达降低,p-GSK-3β和Cleaved Caspase-3表达增加,NF-κB活力增加;FG组较HG组p-AKT表达降低,p-GSK-3β和Cleaved Caspase-3表达增加,NF-κB活力增加(P<0.05)。与FG组相比较,FG+IGF组和FG+RI组p-AKT表达增加,p-GSK-3β和Cleaved Caspase-3表达降低,NF-κB活力降低(P<0.05)。结论:1.血糖波动加重肾小球系膜细胞凋亡;2.血糖波动通过抑制氧化应激和下调AKT信号通路,加重肾小球系膜细胞凋亡。