桑树为多年生木本植物，其生长及育种周期较长，虽然桑树可以通过扦插来扩大栽培面积，但不能保证桑树免受病毒感染和优良种质的延续。随着植物细胞工程的迅猛发展，通过植物细胞工程来改良桑树品种己经成为现代桑树育种的一个必然趋势。目前对于桑树的细胞工程研究多集中在组培快繁、外植体愈伤组织的诱导及转基因等。利用原生质体融合技术进行桑树育种的研究少有报道。鉴于此，本试验以桂桑优12号、农桑14号和新桑11号的组培苗为材料，进行了桑树原生质体的分离培养及其融合的研究，初步筛选出了适合桑树原生质分离与纯化、培养、原生质体融合及杂种筛选等的条件和方法。旨在为桑树体细胞杂交育种研究和种质资源保护等提供理论依据。主要研究结果如下：1.明确了桑树愈伤组织的诱导条件，确定了胚型愈伤组织的获得方法。幼嫩的桑树茎段适合愈伤组织诱导。愈伤组织的诱导培养基为：MS+2,4-D2mg/L；愈伤组织继代培养基为：MS+6-BA1.0mg/L+2,4-D2mg/L，经过3次继代，可得到淡黄色、结构松脆的胚性愈伤组织。2.建立了桑树细胞悬浮培养体系，研究了培养材料、培养基配方、初始接种量、摇床转速、蔗糖浓度、换液量、继代周期、培养过程中pH值变化等因素对桑树细胞悬浮培养体系的影响。确定了桑树细胞悬浮培养的最佳条件：以桂桑优12号的幼嫩胚性愈伤组织作为材料，在液体培养基B5+6-BA1.5mg/L+NAA0.15mg/L上，附加蔗糖40g/L，培养瓶的装液量为25mL/50mL，每瓶接种PCV量为1mL，转速为175rpm的摇床上振荡培养，每5d继代1次，每次换液量为15mL。培养21d时，桑树细胞产量最高，达98.1mg/L，细胞生长速度最快，达183.3mg/（L·d）。3.明确了酶液组成成分与浓度对桑树原生质体分离有很大的影响。试验采用100U/mL纤维素酶R-10、150U/mL果胶酶Y-23和6U/mL离析酶R-10组合酶液来分离原生质体，其中添加了细胞-原生质体洗液（1480mg/L CaCl₂·2H₂O，27.2mg/L KH₂PO₄），以0.6mol/L甘露醇作为渗透压调节剂，在28℃酶解温度条件下酶解6h，用桑树胚性悬浮细胞作分离材料可获得7.8×10⁶个/g的原生质体产量，且原生质体活力达91.4%。4.优化了桑树原生质体培养的基本条件和方法。将分离纯化后的桑树原生质体用KPR液体培养基稀释至1×10⁵个/mL，然后在附加6-BA1.0mg/L和2,4-D0.2mg/L，以0.6mol/L葡萄糖作为渗透剂的KPR培养基上，采用低熔点琼脂糖包埋培养。在第5⁶d可以看到第一次细胞分裂，第13¹7d时发生大量的细胞分裂，培养15d时，桑树原生质体的分裂频率最高，达9.88%，植板率达4.96%。5.试验采用PEG-高Ca²⁺高pH法诱导桂桑优12号原生质体和农桑14号原生质体进行不对称融合。融合前将供体和受体材料分别进行UV辐射处理和IOA处理，研究UV辐射和IOA对原生质体分裂及生长钝化作用，结果表明将供体桂桑优12号原生质体进行辐射强度300μW/（cm²）时，处理时间6min为宜；将受体农桑14号原生质体用16mmo1/L IOA处理10min钝化。在桑树原生质体的融合过程中，诱导剂的分子量和浓度、处理时间和原生质体密度等对原生质体都有影响。试验选用PEG6000浓度为35%时，在原生质体密度为0.5×10⁵个/mL中诱导处理15min时，桑树原生质体聚合率达51.47%，且对桑树原生质体的融合效果好。对融合后的原生质体进行再培养，2h后可以观察到原生质体的聚集，培养25³0d形成了肉眼可见的愈伤组织块。