木糖苷酶是能够水解低聚木糖和木糖苷底物生成木糖的一类糖苷水解酶,在能源工业、食品工业以及医疗行业中有着广泛的应用。木糖苷酶是半纤维素酶系中的关键酶,可分为α-木糖苷酶和β-木糖苷酶两种构型。α-木糖苷酶常用于木葡聚糖的结构修饰和解析;β-木糖苷酶既可以用于促进木聚糖酶降解木聚糖,也可用于相应糖类化合物的结构修饰和分析中。虽然自然界中存在着大量产木糖苷酶的微生物,但其所产木糖苷酶的酶活和酶学特性均不够理想。因此,寻找具有优良性质的木糖苷酶,不仅能够丰富木糖苷酶资源库,同时也能为半纤维素的利用和糖类化合物的结构分析提供有效的工具。本论文以能够有效降解半纤维素的多粘芽孢杆菌和卵形拟杆菌基因组为模板,成功重组表达了三个新的木糖苷酶,并对重组酶的酶学性质进行研究。主要研究成果如下:1.本研究从多粘芽孢杆菌中克隆得到糖苷水解酶家族31（GH 31）的木糖苷酶基因ppxyl6a,从卵形拟杆菌中获得GH 31木糖苷酶基因bogh31b和GH 43木糖苷酶基因boxyl4b。三个基因编码的新木糖苷酶PpXyl6A、BoGH31B和BoXyl4B在原核宿主E.coli BL21（DE3）中均实现了可溶性表达。通过镍柱纯化后可得到纯度较高的目的蛋白,其分子量大小分别为86.7 kDa、88.0 kDa和37.0 kDa。2.对重组木糖苷酶的性质进行研究。三种木糖苷酶在pH 6.0-10.0范围内和30 ℃条件下均具有较高的活性和良好的稳定性。PpXyl6A最适pH为8.0,最适温度40 ℃,BoGH31B和BoXyl4B最适pH分别为6.0和8.5,反应最适温度分别为40 ℃和35 ^o C。Fe³⁺、Hg²⁺、Cu²⁺和EDTA能够完全抑制三个木糖苷酶的活性,Na⁺和K⁺对BoGH31B的活力具有明显的促进作用。以pNPαXyl为底物,PpXyl6A的K_m和V_max值分别为4.2±0.1 mM和1.7±0.1μmol/min/mg,BoGH31B的K_m和V_max值分别为2.4±0.1 mM和3.5±0.2μmol/min/mg,以pNPβXyl为底物,BoXyl4B的K_m和V_max分别为1.1±0.2 mM和7.5±0.2μmol/min/mg,与已报道的β-木糖苷酶相比,BoXyl4B展现出较强的底物亲和力。3.利用一系列pNP-糖苷、寡糖、含有不同寡糖链的人参皂苷和多糖底物对重组木糖苷酶的底物选择性进行研究。结果表明:PpXyl6A是一种选择性较好的外切α-1,6-木糖苷酶,能够作用于异樱草糖和木葡寡糖非还原末端的α-1,6糖苷键,产生木糖,因此可应用于半纤维素结构中木葡寡糖的研究;BoGH31B只能水解pNPαXyl生成木糖,具有外切α-木糖苷酶的活性;BoXyl4B是一种以β-1,4-木糖苷酶活性为主,同时具有α-1,5-阿拉伯呋喃糖苷酶活性的双功能酶,能够作用于低聚木糖非还原端β-1,4糖苷键、阿拉伯寡糖中的α-1,5糖苷键,分别产生木糖单糖和阿拉伯糖。4.对重组酶在寡糖和多糖底物降解中的应用进行了研究。α-木糖苷酶PpXyl6A可以与α-岩藻糖苷酶、β-半乳糖苷酶和木葡聚糖酶共同将木葡寡糖完全降解生成单糖,而BoGH31B则不能。β-木糖苷酶BoXyl4B能够有效促进木聚糖酶降解木聚糖,使还原糖的释放量增加,与木聚糖酶、阿拉伯糖苷酶共同作用于小麦阿拉伯木聚糖时,也可明显提高还原糖的释放量。因此,PpXyl6A和BoXyl4B可被应用于半纤维素的高效转化研究和含有木糖化合物的结构分析中。综上所述,本文共制备了三种木糖苷酶,并研究了其酶学性质,研究结果不仅对于促进半纤维素降解研究具有重要的意义,同时也为分析糖类化合物结构提供了新的工具酶。