【摘 要】
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目的:本研究旨在探讨三维多孔HA陶瓷支架宏孔孔壁表面的条纹样微渠结构在体外对间充质干细胞（MSCs）粘附、增殖及成骨分化的影响,为三维多孔HA陶瓷支架表面微形貌的构建及其在骨组织工程中的应用提供实验基础。方法:实验1:人胎盘来源间充质干细胞（hPMSCs）的体外培养及生物学性能鉴定。通过形态学观察hPMSCs的生长情况及细胞形态、流式细胞仪测定hPMSCs表面标志物CD29、CD90、CD45、C
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目的:本研究旨在探讨三维多孔HA陶瓷支架宏孔孔壁表面的条纹样微渠结构在体外对间充质干细胞（MSCs）粘附、增殖及成骨分化的影响,为三维多孔HA陶瓷支架表面微形貌的构建及其在骨组织工程中的应用提供实验基础。方法:实验1:人胎盘来源间充质干细胞（hPMSCs）的体外培养及生物学性能鉴定。通过形态学观察hPMSCs的生长情况及细胞形态、流式细胞仪测定hPMSCs表面标志物CD29、CD90、CD45、CD106等的表达情况及成骨、成脂、成软骨多向分化潜能。将hPMSCs分别经成骨、成脂、成软骨诱导培养液各诱导培养3周,茜素红S、油红O、甲苯胺蓝分别用于鉴定hPMSCs的三系分化潜能。实验2:新型宏孔孔壁表面具有条纹样微渠结构的三维多孔HA陶瓷支架对人胎盘来源间充质干细胞（hPMSCs）生物学行为的影响。以宏孔孔壁表面具有条纹样微渠结构的多孔HA陶瓷支架（HAW）为实验组,孔壁表面光滑的多孔HA陶瓷支架（HAS）为对照组。将hPMSCs分别与HAS、HAW复合共培养,通过DAPI染色,扫描电镜观察hPMSCs在支架表面的粘附情况及细胞粘附形态。当细胞/支架复合共培养1、3、5、7天时,用CCK-8细胞检测试剂盒测定两组支架材料对hPMSCs增殖情况的影响。碱性磷酸酶（ALP）定量检测细胞/支架复合共培养7、14天时ALP的表达情况。实时荧光定量q PCR检测细胞/支架复合共培养4、7、14天时成骨相关基因ALP、OCN、BMP2、COL-1、Runx2的表达情况,评价新型三维多孔HA陶瓷支架宏孔孔壁表面的条纹样微渠结构对hPMSCs粘附、增殖和成骨分化的影响。结果:实验1:（1）hPMSCs在光学显微镜下呈现典型的间充质干细胞形态,长梭形,螺旋状、旋涡状排列,大小均匀一致。（2）流式细胞仪检测出hPMSCs阳性表达CD29、CD90等干细胞表面标志物,表达量分别为98.14%、99.34%,阴性表达CD45、CD106等造血细胞系表面标志物,表达量分别0.29%、0.43%。（3）hPMSCs在体外分别按成骨、成脂、成软骨三个方向诱导培养3周后,茜素红S染色阳性,有红色的矿化结节形成;油红O染色阳性,可以观察到红色的脂滴;甲苯胺蓝染色可以看到软骨细胞染成蓝色,即hPMSCs具有分化为多个间充质谱系组织的潜能。实验2:（1）DAPI染色,扫描电镜观察到在HAS、HAW支架表面hPMSCs均有很好的黏附,在HAW组中观察到hPMSCs沿着孔壁表面的条纹样结构生长排列,孔壁表面的条纹样微渠结构对细胞的生长排列具有一定的导向作用。（2）CCK-8法检测活细胞数量,发现HAS、HAW两组支架表面均可支撑细胞的增殖生长,随时间增加细胞数量增多,但在1、3、5、7天时两组无统计学差异,P＞0.05。（3）碱性磷酸酶（ALP）定量检测结果发现7天时HAW组OD值高于HAS组,具有统计学差异（P＜0.05）。（4）q PCR检测两组支架上细胞的成骨相关基因的表达量发现,4天时两组的表达量均较低,无统计学差异P＞0.05,7天时HAW组中ALP、BMP2、Runx2基因的表达高于HAS组,具有统计学差异（P＜0.05）,14天时HAW组中BMP2、OCN、COL-1高于HAS组,具有统计学差异（P＜0.05）。结论:1、hPMSCs具有干细胞典型的生物学特征,体外诱导培养可以向成骨细胞、脂肪细胞、成软骨细胞分化,具有分化为多个间充质谱系组织的潜能,可以用作组织工程种子细胞。2、新型宏孔孔壁表面具有条纹样微渠结构的三维多孔HA陶瓷支架可以作为载体供hPMSCs粘附、生长和增殖,对细胞的生长排列有一定的引导作用,成骨相关基因的表达上调促进hPMSCs的成骨分化及成骨细胞的成熟。
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