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目的:以FPS-ZM1拮抗人牙周膜成纤维细胞（hPDLFs）表面晚期糖基化终末产物受体（RAGE）,观察高糖情况下RAGE的表达情况,以及FPS-ZM1作用下hPDLFs增殖、迁移的情况。探讨运用小分子RAGE拮抗剂将hPDLFs表面RAGE作为药物靶点改善高糖环境下牙周膜损伤修复的可行性。方法:1 hPDLFs细胞的培养与鉴定:选取青少年正畸拔除的前磨牙,年龄限定为12～16岁,刮取前磨牙牙根中1/3的牙周膜组织,采用酶消化组织块法进行体外培养并传代,镜下观察细胞形态。取3代细胞制作细胞爬片,通过DAB染色检测keratin和Vimentin两种特异性蛋白,确定细胞生物学来源。结合细胞形态学观察和免疫组化染色鉴定人牙周膜成纤维细胞。2 hPDLFs的RAGE表达测定:取5代细胞接种于6孔板,接种密度以4×10~5个/孔,分别用高低糖DMEM培养基进行细胞培养,裂解细胞后提取蛋白,Western-blot方法检测两组RAGE蛋白的表达。3 hPDLFs的增殖测定:取5代细胞接种于96孔板,接种密度为1×10~4个/孔,设立L、H、H+F1、H+F2、H+F3、H+F4六个组。3.1配置不同培养基:L低糖DMEM培养基;H高糖DMEM培养基;H+F1含250n M FPS-ZM1的高糖DMEM培养基;H+F2含500n M FPS-ZM1的高糖DMEM培养基;H+F3含750n M FPS-ZM1的高糖DMEM培养基;H+F4含1000n M FPS-ZM1的高糖DMEM培养基。3.2每24h测定一个96孔板各孔在450nm波长处的OD值,连续检测4天,收集数据,统计分析。以时间为横轴,OD值为纵轴,绘制hPDLFs的生长曲线。4 hPDLFs的迁移测定:本实验分L、H、H+F三组。采用细胞划痕实验的方法检测hPDLFs的迁移数量。4.1配置三种培养基（含2%FBS）:L组低糖DMEM培养基;H组高糖DMEM培养基;H+F组含250n M FPS-ZM1的高糖DMEM培养基.4.2用marker笔在6孔板背面划六条均匀平行横线,间距约0.5cm,每孔有三条横线通过。4.3将第5代人牙周膜成纤维细胞接种于6孔板内,接种密度均为4×10~5个/孔。4.4细胞培养3天,hPDLFs细胞密度接近80%,用200μl无菌枪头在孔板底面划均匀竖线,该线与孔板背面的标记线垂直,间距约0.5cm。形成6孔培养板中宽度均匀一致的无细胞区。沿孔壁加入PBS液清洗2次,倒置显微镜观察并采集图像。更换培养基,将配置的三种培养基加入相应的6孔板中,置于CO2孵箱中培养。4.5在24h、36h、48h这三个时间点采集图像,观测各组细胞向划痕中央爬行的数目,作为衡量细胞迁移能力的指标,以L组细胞迁移数量为参照绘图。本实验至少重复3次,收集数据,统计分析。实验数据采用spss17.0软件进行统计处理,单因素方差分析及SNK检验进行比较,差异显著性的检验水平为p＜0.05。结果:1细胞的培养与鉴定结果:镜下观察原代培养8-14天少量细胞脱离组织块在培养皿内贴壁生长,约3周后贴壁细胞长满培养皿。贴壁细胞呈长梭状,少数细胞呈不规则多角形,生长密集时放射状排列,胰酶消化时脱离培养皿呈圆形并聚集形成大小不等的细胞团。细胞爬片DAB染色显示培养细胞Vimentin染色呈阳性,keratin染色呈阴性。2 hPDLFs的RAGE表达测定结果显示,在高低糖两种培养条件下hPDLFs培养,hPDLFs细胞中的RAGE蛋白均有表达,低糖组蛋白条带平均灰度值为246,高糖组蛋白条带平均灰度值为252。低糖组蛋白条带平均灰度值低于高糖组。3 hPDLFs的迁移测定结果显示,L组与其余五组间比较有统计学意义（p＜0.05）,cck-8结果显示细胞增殖能力L组最高,说明高糖环境抑制hPDLFs的增殖。H与H+F1、H+F2、H+F3、H+F4四组间比较有统计学意义（p＜0.05）,H组OD值最低,提示FPS-ZM1作用于细胞可促进增值。H+F1与H+F2、H+F3、H+F4三组间比较有统计学意义（p＜0.05）,提示FPS-ZM1浓度在1000n M以250n M时促增值作用最明显。H+F2、H+F3、H+F4三组间比较无统计学意义（p＞0.05）。细胞划痕实验L组与H、H+F两组比较有统计学意义（p＜0.05）,H、H+F两组细胞迁移数量明显低于L组,提示hPDLFs细胞迁移能力高糖环境中低于低糖。H、H+F两组间比较有统计学意义（p＜0.05）,同时H组hPDLFs迁移数量又低于H+L组,提示FPS-ZM1促进了hPDLFs细胞的迁移活动。结论:1原代培养的细胞呈长梭状,放射状排列,符合hPDLFs的形态学特点,细胞爬片染色显示Vimentin染色阳性,keratin染色阴性。显示细胞的中胚层来源,符合hPDLFs的免疫组织化学特征。两者结合鉴定检测细胞为hPDLFs细胞。2高糖环境下,hPDLFs的RAGE表达增高。3实验发现高糖环境抑制hPDLFs的增殖、迁移。FPS-ZM1拮抗RAGE后对hPDLFs增殖、迁移有促进作用,且FPS-ZM11000n M以内,浓度为250n M时促增殖作用最强。