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目的:1.研究不同浓度N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine,NAC）和脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）在不同时间点对MC3T3-E1细胞增殖情况的影响。2.观察不同浓度的NAC和LPS对MC3T3-E1细胞形态的影响。3.研究NAC和LPS对MC3T3-E1细胞矿化能力的影响。4.研究NAC和LPS对MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶活性的影响。5.研究在LPS的刺激下,NAC对MC3T3-E1细胞的相关细胞因子TNF-α、NF-κB、BGP、Runx2、ALP表达的调控作用。方法:体外培养MC3T3-E1细胞,并按照实验分组和目的进行研究。实验分为:对照组、NAC组、LPS组、NAC+LPS组。其中,对照组中不含刺激因素;NAC组中仅有NAC作用细胞;LPS组中仅有LPS刺激细胞;NAC+LPS组中先用NAC作用细胞2小时后加入NAC与LPS的混合液。1.利用不同浓度的NAC（0mmol/L、0.25mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、2.5mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L）和LPS（0μg/m L、1μg/m L、1.5μg/m L、2.5μg/m L、5μg/m L、10μg/m L、20μg/m L、25μg/m L、50μg/m L）刺激MC3T3-E1细胞,连续培养6h、24h、48h、72h后,通过CCK-8观察细胞增殖情况。2.观察MC3T3-E1细胞在浓度为0.5mmol/L NAC和20μg/m L LPS作用下,细胞培养36小时后的形态变化。3.检测MC3T3-E1细胞在不同浓度的NAC（0mmol/L,0.5mmol/L,1mmol/L,5mmol/L,10 mmol/L）和LPS（0μg/m L、5μg/m L、10μg/m L、20μg/m L、25μg/m L）的作用下,细胞培养6天后碱性磷酸酶活性的变化。4.观测MC3T3-E1细胞在浓度为0.5mmol/m L NAC和20μg/m L LPS的作用下培养30天后细胞矿化结节的形成情况。5.MC3T3-E1细胞在浓度为0.5mmol/m L NAC和20μg/m L LPS的作用下分别培养48小时后,利用RT-PCR观测细胞中炎性相关细胞因子TNF-α、NF-κB和骨形成相关因子BGP、Runx2、ALP mRNA的表达。6.MC3T3-E1细胞在浓度为0.5mmol/m L NAC和20μg/m L LPS的作用下分别培养24、48、72小时后,利用ELISA观测细胞中炎性相关细胞因子TNF-α、NF-κB和骨形成的相关因子BGP、Runx2、ALP蛋白的表达。结果:1.细胞在不同浓度的NAC和LPS作用下分别在6h、24h、48h、72h对细胞增殖情况的影响作用:1.1细胞在不同浓度的NAC作用下,测得的OD值统计结果如下:（1）在作用6h时,NAC浓度在0～0.5mmol/L之间,OD值随浓度的升高而升高,0.5mmol/L以后OD值随浓度的升高而降低。（2）在作用24h时,NAC浓度在0～5mmol/L之间,OD值随浓度的升高而升高,5mmol/L以后OD值随浓度的升高而降低。（3）在作用48h时,NAC浓度在0～0.25mmol/L之间,OD值随浓度的升高而升高,2.5～20mmol/L以后OD值随浓度的升高而降低。（4）在作用72h时,NAC浓度在0～0.5mmol/L之间,OD值随浓度的升高而升高,0.5～20mmol/L以后OD值随浓度的升高而降低。以上结果均P＜0.05,有统计学意义。1.2细胞在不同浓度的LPS作用下,测得的OD值统计结果如下:（1）在作用6h时,LPS浓度在0～1.5μg/m L之间,OD值随浓度的升高而升高,20～25μg/m L以后OD值随浓度的升高而降低。（2）在作用24h时,LPS浓度在0～5μg/m L之间,OD值随浓度的升高而升高,20～25μg/m L之间OD值随浓度的升高而降低。（3）在作用48h时,LPS浓度在0～2.5μg/m L之间,OD值随浓度的升高而升高。（4）在作用72h时,LPS浓度在0～1μg/m L之间,OD值随浓度的升高而升高,20～50μg/m L以后OD值随浓度的升高而降低。以上结果均P＜0.05,有统计学意义。2.细胞形态学观察结果显示:0.5mmol/L NAC和20μg/m L LPS处理36h后,NAC组与对照组没有明显差异,细胞形态基本一致;LPS组,细胞由梭形变成椭圆,细胞皱缩并且胞核变小,缺少光泽;NAC+LPS组中可见大部分细胞形态不变,仅有少部分细胞皱缩成圆形或者椭圆形。3.碱性磷酸酶活性测定结果碱性磷酸酶结果显示:（1）NAC在浓度为0mmol/L～0.5mmol/L时,碱性磷酸酶活性随NAC浓度的升高而增加,NAC在浓度为0.5mmol/L～10m mol/L时,碱性磷酸酶活性随浓度升高而减小（P＜0.05）。（2）碱性磷酸酶结果显示LPS在浓度为在浓度为20μg/m L～25μg/m L范围内,碱性磷酸酶活性随浓度的升高而减小（P＜0.05）。4.矿化结节的茜素红染色结果经0.5mmol/L NAC和20μg/m L LPS作用30天后,MC3T3-E1细胞通过茜素红染色矿化结节可见:4个组均出现不同程度的矿化结节染色,矿化结节染色呈红色。NAC组明显比对照组、N+L组、LPS组形成的矿化结节数目多,并且连接成片。N+L组与对照组形成矿化结节的面积差别不大,但是没有成簇形成。LPS组明显矿化能力弱,22天观察没有明显钙结节形成,30天染色可见小而弥撒的矿化结节,较其他组少。5.NAC调控LPS刺激MC3T3-E1细胞后相关因子mRNA的表达成骨细胞在浓度为0.5mmol/L NAC和20μg/m L LPS的作用下按照分组情况培养48天后,检测各个细胞因子的mRNA的表达。（1）ALPmRNA的表达:NAC组ALPmRNA的表达高于LPS组,N+L组ALPmRNA的表达高于LPS组,P＜0.05,差异有统计学意义。（2）Runx2mRNA的表达:LPS组Runx2mRNA的表达低于对照组、NAC组和N+L组,P＜0.05,差异有统计学意义。（3）BGPmRNA的表达LPS组BGPmRNA的表达低于NAC组,N+L组高于LPS组,P＜0.05,差异有统计学意义。（4）TNF-αmRNA的表达:NAC组TNF-αmRNA的表达低于对照组,LPS组高于对照组和NAC组,N+L组低于LPS组,P＜0.05,差异有统计学意义。（5）NF-κB mRNA的表达:LPS组NF-κB mRNA的表达大于NAC组和N+L组,P＜0.05,差异有统计学意义。6.NAC调控LPS刺激MC3T3-E1细胞后相关因子蛋白的表达（1）Runx2蛋白表达:在48h和72h,LPS组蛋白表达均低于NAC组和N+L组,各组Runx2蛋白表达随时间增长逐渐降低。P＜0.05,有统计学意义。（2）BGP蛋白表达:在48小时,NAC组BGP蛋白表达高于对照组和LPS组;在72h时,N+L组高于LPS组,P＜0.05,有统计学意义。（3）ALP蛋白表达:在48小时,ALP蛋白表达NAC组＞N+L组＞LPS组,且各组均高于24h;72h时N+L组高于LPS组,P＜0.05,有统计学意义。（4）TNF-α蛋白表达:LPS明显在3个时间点均高于对照组、NAC组和N+L组,P＜0.05,有统计学意义。（5）NF-κB蛋白表达:LPS明显在3个时间点均高于对照组、NAC组和N+L组,P＜0.05,有统计学意义。结论:1.NAC在0～0.5mmol/L之间对增殖细胞有促进作用,在0.5mmol/L以后对细胞增殖开始出现抑制作用。LPS在1～5μg/m L之间对增殖细胞有促进作用,20μg/m L以后对细胞增殖开始出现抑制作用。综合结果,得出NAC处理MC3T3-E1细胞的最佳浓度为0.5mmol/L。而LPS刺激MC3T3-E1细胞的最佳浓度为20μg/m L。2.用0.5m mol/L NAC作用细胞,不影响细胞形态,20μg/m L LPS对细胞形态有影响。LPS作用后细胞由梭形或扁平形变成椭圆形或圆形,细胞膜完整,但有明显皱缩且胞核变小,细胞失去光泽。3.NAC在浓度为0mmol/L～0.5mmol/L时,对碱性磷酸酶活性有促进作用,NAC在浓度为0.5mmol/L～10mmol/L时,对碱性磷酸酶活性有抑制作用。LPS浓度在0μg/m L～10μg/m L不会改变碱性磷酸酶的活性。LPS在浓度为20μg/m L～25μg/m L时,LPS对碱性磷酸酶活性有抑制作用。4.浓度为0.5mmol/L NAC能促进MC3T3-E1细胞矿化结节的形成。NAC可以调节LPS作用下,成骨细胞的矿化能力,起促进作用。5.NAC对LPS降低ALP、Runx2、BGPmRNA的表达和促进TNF-α、NF-κBmRNA的表达有抑制作用。6.NAC对LPS降低ALP、Runx2、BGP细胞因子蛋白的表达和促进TNF-α、NF-κB细胞因子蛋白的表达有抑制作用。