类胡萝卜素作为维生素A的前体,可以清除自由基,预防癌症,保护人体免疫系统。许多粮食作物仅含有少量的类胡萝卜素,而且类胡萝卜素作为脂溶性物质,当单纯摄入主粮作物时吸收率较低,食物中的油脂对类胡萝卜素的吸收具有显著的协同作用,所以提高油料作物的类胡萝卜素含量,可以有效提高人体对类胡萝卜素的摄取量。甘蓝型油菜作为我国重要的油料作物,在以往油菜品质改良中,以低芥酸和低硫苷的双低油菜为主,然而随着人们需求的变化,人们对油菜的品质提出更高的要求,促使提高油菜其他品质,所以培育高类胡萝卜素含量的油菜品种成为油菜育种的新目标。本研究以甘蓝型油菜为材料,利用CRISPR/Cas9技术对BnaCCD4的三个拷贝（Bna A1CCD4、BnaC1CCD4和Bna A8CCD4）进行敲除,进而创造不同CCD4拷贝组合的突变株系,为CCD4不同拷贝的功能分化研究奠定基础,为油菜种子类胡萝卜素改良提供种质资源。主要研究结果如下:1.甘蓝型油菜种子中类胡萝卜素定性定量分析:利用高效液相色谱（High performance liquid chromatography,HPLC）对中双11、华双五号等17个不同品种的甘蓝型油菜种子进行检测,结果表明其类胡萝卜素种类均主要为叶黄素和β-胡萝卜素,在这些品种中,华5861的叶黄素含量最高,为39.27μg/g,而华572的含量最低,为6.02μg/g,相差6.5倍;华291的β-胡萝卜素含量最高,为2.21μg/g,而华288最低,为0.08μg/g,相差27.6倍,表明不同品种间类胡萝卜素类型差异较小,但是含量存在显著差异。2.甘蓝型油菜BnaCCD4基因序列分析:通过对基因序列分析发现,甘蓝型油菜基因组存在四个同源基因Bna A1CCD4、BnaC1CCD4、Bna A8CCD4和BnaC3CCD4,而BnaC3CCD4存在7.6 kb的CACTA转座子的插入,Bna A1CCD4和BnaC1CCD4的CDS序列的相似性为97%;Bna A8CCD4与Bna A1CCD4和BnaC1CCD4的CDS序列的相似性分别为86%和88%。三个拷贝的核苷酸序列之间的相似性,说明它们之间的功能可能存在相似性。3.甘蓝型油菜BnaCCD4基因表达模式分析:在甘蓝型油菜品系甲9707中利用q PCR对BnaCCD4的3个同源基因（Bna A1CCD4、BnaC1CCD4和Bna A8CCD4）的转录水平进行检测,结果显示它们在油菜的茎、叶、花和种子中均有表达,在根和角果中表达量较低。对于不同发育时期的种子,在开花后10到50天的发育种子中,Bna A1CCD4和BnaC1CCD4的表达量在10到20天表达量较低,从25天表达量开始上升,在开花后50天的种子中两个拷贝的表达量达到峰值;而Bna A8CCD4的表达量在开花后10到25天随种子发育时期推进而下降,然后在开花后25到40天随种子发育时期推进而上升,在开花后50天有开始下降。三个拷贝在植物的不同组织和种子的不同发育时期的表达量存在显著差异。4.BnaCCD4多种甘蓝型油菜突变体材料的获得:利用基因编辑技术,针对不同拷贝分别设计五个不同的特异性靶点,分别构建p YLCRISPR/Cas9Pubi-H-9TD和p YLCRISPR/Cas9Pubi-H-9T3两个敲除载体。利用农杆菌介导法将两个载体转化至甲9707,分别获得16株p YLCRISPR/Cas9Pubi-H-9TD载体编辑植株和获得38株p YLCRISPR/Cas9Pubi-H-9T3载体编辑植株,其中包括三种单突变体Bna A1ccd4、BnaC1ccd4和Bna A8ccd4,三种双突变体Bna A1ccd4BnaC1ccd4、Bna A1ccd4Bna A8ccd4、BnaC1ccd4Bna A8ccd4、和三突变体Bna A1ccd4BnaC1ccd4Bna A8ccd4,这7种突变体材料可以为以后研究BnaCCD4三个拷贝功能的分化提供材料。5.BnaCCD4突变株系种子中类胡萝卜素含量的检测:利用HPLC检测T1代纯合三突株系208、209和29-2种子中类胡萝卜素的含量,结果表明甲9707和突变株系种子中类胡萝卜素的类型主要包括叶黄素和β-胡萝卜素。其中突变株系29-2的种子中叶黄素含量为97.19μg/g,同甲9707相比,含量提高了5.8倍;β-胡萝卜素含量为20.25μg/g,同甲9707相比,含量提高了12.82倍;同时在突变株系中都检测到β-隐黄质,含量为3.33μg/g。通过利用基因编辑技术突变甘蓝型油菜的BnaCCD4的三个拷贝,可以显著提高油菜种子中类胡萝卜素的含量,尤其是β-胡萝卜素的含量。