论文部分内容阅读
1.1研究背景卵巢癌的发病率在女性生殖恶性肿瘤中位居第三,其致死率则高居榜首。例如,2017年在美国约有14,080人死于卵巢癌。近几十年来,卵巢癌的诊疗有三大进展,即科学的手术病理分期、最大限度的减瘤手术及铂类和紫杉醇配伍的联合化疗,这些进展使卵巢癌患者的5年生存率已由70年代的35%左右上升到目前的50%。但截至目前,仍无有效的生物标志分子应用于卵巢癌的早期诊断,导致70-80%的患者就诊时已属晚期,此阶段的病人用传统的手术、化疗和放疗常常难以治愈。即使暂时缓解和无进展生存期延长,但仍有约60%以上的患者会复发。因此,找出潜在的预后生物标志物对于开发卵巢癌新的治疗靶点、最终改善这种疾病的结局具有重大的意义。CD8~+细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)能特异性杀死肿瘤细胞,在抗肿瘤免疫中发挥重要作用。然而,肿瘤微环境(Tumor microenvironment,TME)中的诸多因素会诱导CD8~+T细胞上调抑制性受体程序性死亡受体-1(Programmed cell death protein-1,PD-1)的表达,后者通过与肿瘤细胞表面的配体即程序性死亡-配体1(Programmed death-ligand 1,PD-L1)结合,显著抑制CD8~+CTL清除肿瘤细胞的能力。虽然大量的基础研究和临床实验已经证明抗PD-1或抗PD-L1的抗体能显著增强机体清除肿瘤的效率,但仍有80%左右的患者在使用抗PD-1或抗PD-L1的抗体治疗后显示效果不佳。从现有的临床数据来看,PD-1阻断剂仅对某些肿瘤的一小部分患者有效。那么,为何同样是PD-1表达阳性的患者却有着截然不同的疗效?为何PD-1阳性的肿瘤特异性T细胞在接受PD-1阻断剂处理之后仍无法恢复其抗肿瘤的免疫活性?这些问题也是目前卵巢癌免疫治疗发展遇到的瓶颈。最近,Mary Philip等人的研究报道,小鼠肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)高表达PD-1,其分化会经历两个独立的染色质状态,并且这些状态能够反应到相应的表面标记上:一种是可逆的功能紊乱状态(状态1),这个状态的CD8~+T细胞低表达CD38、CD101,这群细胞经体外刺激能重新恢复分泌γ-干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的能力,从而恢复了CD8~+T细胞对肿瘤的杀伤能力;另一种则是不可逆的功能紊乱状态(状态2),这个状态的CD8~+T细胞高表达CD38、CD101,这群细胞即使经过体外数轮刺激仍不能重新恢复分泌IFN-γ和TNF-α。这两种状态中的PD-1~+CD8~+T细胞上CD38和CD101的共表达状况很可能与PD-1/PD-L1阻断剂的治疗效果有关,且这两群不同功能状态的PD-1~+CD8~+T细胞在卵巢癌患者体内的频率可能是卵巢癌患者预后的关键指标。因此,我们对卵巢癌患者的外周血、癌组织中的PD-1~+CD8~+T细胞表面CD38/CD101的表达和分布情况进行研究,分析PD-1~+CD8~+T细胞亚群与卵巢癌患者年龄、临床分期、组织病理学分级、淋巴结转移以及术后化疗的疗效指标(血清CA125和HE4检测值)是否恢复正常的相关性。判断CD38/CD101在PD-1~+CD8~+T细胞的表达对卵巢癌病人诊断和疗效的指示性作用,为卵巢癌的临床诊断、治疗以及预后判断提供帮助。1.2研究方法1.2.1运用免疫荧光染色技术(Immunofluorescence,IF)检测CD38分子和CD101分子在卵巢癌患者TILs中的表达和定位情况。1.2.2应用流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测卵巢癌患者、正常人外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)和卵巢癌TILs中PD-1~+/PD-1~+CD38~+CD101~-/PD-1~+CD38~-CD101~+/PD~-1~+CD38~+CD101~+/PD-1~+CD38~-CD101~-/PD-1~-/PD-1~-CD38~+CD101~-/PD-1~-CD38~-CD101~+/PD~-1~-CD38~+CD101~+/PD-1~-CD38~-CD101~-的CD8~+T细胞亚群频率。1.2.3运用多种统计学方法分析各PD-1~+CD8~+T和PD-1~-CD8~+T细胞亚群的频率及其与卵巢癌临床病理参数和疗效指标的相关性。1.3研究结果1.3.1 CD38和CD101在卵巢癌TILs中表达与定位 我们运用免疫荧光双染技术检测了卵巢癌患者手术切除组织中CD38和CD101的共定位情况和表达水平,结果显示CD38和CD101都在卵巢癌组织中高表达,其主要表达在组织浸润淋巴细胞包膜上,且存在共定位。癌旁组织中淋巴细胞浸润非常少且都不表达CD38和CD101。1.3.2 CD38和CD101在卵巢癌患者外周血PD-1~+CD8~+T细胞上表达及临床相关性分析 本章实验中,我们成功运用梯度密度离心法分离了卵巢癌患者组和健康对照组PBMCs,anti-CD3-PerCP、anti-CD8-FICT、anti-PD-1-PE/Cy7、anti-CD38-PE和anti-CD101-APC流式抗体染色后,用FCM检测分析PD-1~+/PD-1~-CD8~+T细胞各亚群频率。用独立样本T检验统计分析卵巢癌患者组与健康对照组PD-1~+/PD-1~-CD8~+T细胞各亚群频率。结果显示:卵巢癌患者组外周血PD-1~+CD8~+T细胞亚群中,总PD-1~+CD8~+T细胞频率显著高于健康对照组,PD-1~+CD38~-CD101~+/PD-1~+CD38~+CD101~+CD8~+T细胞亚群频率比健康对照组显著升高,PD-1~+CD38~+CD101~-/PD-1~+CD38~-CD101~-CD8~+T细胞亚群频率比健康对照组显著降低;在PD-1~-CD8~+T细胞亚群中,总PD-1~-CD8~+T细胞频率显著低于健康对照组,PD-1~-CD38~-CD101~+/PD-1~-CD38~+CD101~+CD8~+T细胞亚群频率比健康对照组显著升高,PD-1~-CD38~+CD101~-/PD-1~-CD38~-CD101~-CD8~+T细胞亚群频率比健康对照组显著降低。我们运用统计学卡方检验分析了卵巢癌患者外周血PD-1、CD38、CD101在CD8~+T细胞上表达频率与卵巢癌临床参数的相关性,结果显示:所有CD8~+T细胞亚群均与患者年龄、组织病理学分级不相关(p>0.05);总PD-1~+/PD-1~-CD8~+T细胞亚群频率均与卵巢癌临床病理参数不相关(p>0.05);CD38、CD101在PD-1~+/PD-1~-CD8~+T细胞亚群中的单阳性表达均与卵巢癌临床病理参数不相关(p>0.05),CD38/CD101在PD-1~+/PD-1~-CD8~+T细胞亚群中的双阳和双阴性表达与临床分期、肿瘤等级和淋巴结转移显著相关(p<0.05)。我们还分析了卵巢癌外周血CD8~+T细胞上PD-1、CD38、CD101表达频率与术后化疗疗效的相关性。结果显示:总PD-1~+CD8~+T细胞表达频率与疗效不相关(p>0.05),CD38、CD101在PD-1~+CD8~+T细胞亚群上单表达与疗效也不相关(p>0.05),但CD38/CD101在PD-1~+CD8~+T细胞亚群上双阳性和双阴性表达频率与疗效显著相关(p<0.05)。总PD-1~-CD8~+T细胞频率与疗效不相关(p>0.05),CD38在PD-1~-CD8~+T细胞亚群上表达频率与疗效不相关(p>0.05),但CD101在PD-1~-CD8~+T细胞亚群上表达频率与疗效显著相关(p<0.05),且CD38/CD101在PD-1~-CD8~+T细胞亚群上双阳性和双阴性表达频率与疗效显著相关(p<0.05)。1.3.3 CD38和CD101在卵巢癌TILs PD-1~+CD8~+T淋巴细胞上表达与临床相关性分析 我们通过机械法、化学法及酶消化处理相结合制备肿瘤浸润淋巴细胞单细胞悬液,再利用淋巴细胞分离液进行梯度离心。anti-CD3-PerCP、anti-CD8-FICT、anti-PD-1-PE/Cy7、anti-CD38-PE和anti-CD101-APC流式抗体染色后,用FCM检测分析PD-1~+/PD-1~-CD8~+T细胞各亚群的频率。用非参数检验分析卵巢癌组织浸润淋巴细胞中PD-1、CD38、CD101在CD8~+T细胞的表达水平及其与卵巢癌临床病理参数和术后化疗疗效的相关性。结果显示与外周血非常类似,即在卵巢癌组织浸润淋巴细胞PD-1~+CD8~+T细胞中,CD38、CD101单阳性表达频率与临床病理参数和疗效不相关,而CD38和CD101表达双阳性和双阴性与临床分期、淋巴结转移以及疗效显著相关。1.4结论PD-1~+/PD-1~-CD8~+T细胞中CD38/CD101双阳性细胞在卵巢癌患者外周血和肿瘤组织中的比例显著升高,相较于其它PD-1~+/PD-1~-CD8~+T细胞亚群,PD-1~+CD38~+CD101~+CD8~+T细胞的频率与卵巢癌患者的临床分期、淋巴结转移及术后化疗疗效的相关性最为密切,而与卵巢癌患者年龄、组织病理分级无关。且CD38和CD101共表达水平越高,卵巢癌恶性程度越高,术后化疗疗效越差。因此,CD38和CD101在PD-1~+/PD-1~-CD8~+T细胞共表达频率可作为卵巢癌患者辅助诊断和预测预后的指标之一,并有可能作为判断卵巢癌患者抗PD-1免疫治疗适用性的辅助生物学指标。