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背景和目的：脉冲电磁场(Pulsed Electromagnetic Fields, PEMFs)作为一种非侵入性治疗方法被用于治疗骨折延迟愈合、骨不连、骨质疏松症等骨科疾病。细胞是组织构建的基础,体外构建组织工程骨要想满足临床需要,如何使种子细胞大量、快速、优质扩增是面临的首要问题。本实验前期工作证明,高频脉冲电磁场(High-Frequency Pulsed Electromagnetic Fields, HF-PEMFs)能够对大鼠骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem cells, BMSCs)的增殖和诱导成骨产生抑制作用。然而刺激的频率不同,是否会对细胞增殖及分化产生不同的影响?在组织工程骨的体外构建中我们应该选择怎样的合适频率范围?细胞是以群体而不是以孤立的形式生长,细胞间存在物质和信息交换,脉冲电磁场通过何种信号传导旁路产生影响,进而影响细胞增殖分化和诱导成骨?这些问题尚缺乏系统的研究。本研究旨在探讨1KHz频率段PEMFs刺激对大鼠BMSCs体外增殖分化的作用,以期找出适合的频率范围,为应用PEMFs促进大鼠BMSCs快速大量优质扩增,诱导成骨分化,研制新型生物反应器,以及进一步研究PEMFs刺激对BMSCs生物学效应的机制提供实验依据。方法：1、分组应用全骨髓细胞贴壁分离培养法分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,将体外培养的第三代BMSCs分为PEMF刺激组和不施加PEMF的对照组。2、参数选择：脉冲电磁场刺激强度0.05mT,时间60min/d,持续作用15天。3、倒置相差显微镜观察细胞形态。4、四氮噻唑盐(MTT)比色法检测BMSCs的增殖,绘制细胞生长曲线。5、流式细胞仪检测BMSCs表面抗原CD29.CD31、CD44、CD45和CD105表达率,并于不同时间测定两组细胞增殖率及生长周期。6、酶化学法测定细胞碱性磷酸酶(ALP)活性。7、Vonkossa钙染色检测钙结节的形成。8、基因芯片测定差异表达基因,选取FC>2差异基因进行生物信息学分析,预测其趋势及旁路,并选取感兴趣的BMP-2、Id2、ALP、Decorin进行实时荧光定量PCR验证。结果：1、经PEMFs刺激的BMSCs,3d后密度一直较对照组增高,体积逐渐增大,随培养时间延长,细胞逐渐汇合呈铺路石状,进而出现重叠生长。2、MTT检测显示经PEMFs刺激后的BMSCs增殖能力明显比对照组强,实验组较对照组生长曲线前移,并且峰值增高(P<0.05)。3、流式细胞仪检测表明：BMSCs表面抗原CD29、CD44、CD45阳性表达,CD31和CD105阴性表达；PEMFs组细胞增殖活率较对照组高(P<0.05)；而且经PEMFS作用以后,所有样本均未发现有DNA倍体异常的细胞(diploid:100%),BMSCs细胞周期发生了改变,PEMFs组S期细胞百分比增高(P<0.05)。4、ALP活性检测：PEMFs组BMSCs的ALP水平比对照组有增高,随着刺激时间延长,PEMF刺激组ALP活性增强更为明显,12d基本达到高峰；15d时变化不大,基本到达稳定值(P<0.05)。5、Vonkossa钙染色检测：第1周两组间钙结节染色均不明显；第2周始PEMFs组经染色的钙结节计数明显多于对照组。6、基因表达谱芯片：测定的上调基因主要涉及骨的矿化,神经的分化和发育,血管生成和发育等；BMP-2,ALP,Id2表达在PEMFs组均明显增高(P<0.05)；PEMFs可能通过TGF-beta信号传导旁路参与促进BMSCs增殖及成骨分化。结论：本实验成功培养SD大鼠骨髓间充质干细胞。频率和照射时间是影响脉冲电磁场促人间充质干细胞增殖分化的重要因素。脉冲电磁场刺激频率不同,对间充质干细胞的促增殖分化作用不一,1KHz脉冲电磁场可能是促进BMSCs体外增殖和成骨分化的适合频率。PEMFs可能通过TGF-beta信号传导旁路发挥促进作用,该旁路中的BMP.2.ld2有利于促进BMSCs成骨分化及维持内环境的稳态。但具体通过该旁路中的哪一途径促进细胞增殖,尚有待进一步研究。