复方黄黛片(Compound Realgar Natural Indigo Tablets，CRNIT)，临床研究证明对急性早幼粒细胞白血病(APL)可达到治愈的效果。由雄黄、青黛、太子参和丹参等药物组成处方，其中雄黄为君药，青黛为臣药，丹参和太子参为佐使药。已有研究从分子生物学和生物化学的角度，研究了复方黄黛片治疗APL的分子机理，他们认为有效成分为丹参酮Ⅱ A(TanshinoneⅡ A，T)、靛玉红(Indirubin，Ⅰ)和四硫化四砷（Tetraarsenic tetrasulfide，As4S4，A），并且这三者在药效上有相互协同的作用。本研究拟建立丹参酮ⅡA和靛玉红的体内药物浓度检测方法，从体内药代的角度，考察其组方的合理性，从而对临床用药以起到指导作用，亦可为本方的继续深入研究和其它经典验方的研究提供借鉴。　　 一、丹参酮ⅡA和靛玉红大鼠血药浓度以及血砷测定方法的建立　　 本研究建立丹参酮ⅡA和/或靛玉红血浓度的高效液相三重四极杆质谱联用(LC-MS/MS)测定法，建立血砷浓度的ICP-AES和ICP-MS测定法。　　 取血浆样本0.1mL，加入40μg·L-1氯雷他定10μL（丹参酮ⅡA的内标）/25μg·L-1大黄酚10μL（靛玉红的内标），混匀后加入0.3mL乙腈混旋10min，30000rpm离心10min，取0.2mL上清液进样分析。以乙腈：水(70:30)为流动相，流速为0.3mL·min-1:丹参酮11A采用Shimadzu ODS柱，内径2.2μm，正离子检测，检测离子对为m/z295.2→277.1，氯雷他定的离子对为m/z383.2-→267.1;靛玉红采用Agilent C18柱，内径3.5μm，采用负离子检测，检测离子对为m/z260.9→156.9，大黄酚的离子对为m/z253.0→225.0。　　 取0.5g全血，加入混酸密闭消解，稀释后离心取上清进样ICP-AES或ICP-MS。　　 丹参酮ⅡA浓度在0.2～100μg·L-1范围内与丹参酮ⅡA/氯雷他定的峰面积比呈良好线性关系，回归方程为：Y=0.443C+0.0586，r=0.9963，n=6。丹参酮ⅡA的最低检测限为0.2μg·L-1，低、中、高浓度质控样品的批间精密度分别为5.1％、5.7%和5.3%。低、中、高浓度和内标的提取回收率在94.5%～104.9%，室温稳定性、冻融稳定性及30天稳定性考察结果均满意。　　 靛玉红浓度在0.2～100μg·L-1范围内与靛玉红/大黄酚的峰面积比呈良好线性关系，回归方程为：Y=0.199C+0.0042（r=0.9968,n=6）。靛玉红的最低检测限为0.1μg·L-1，低、中、高浓度质控样品的批间精密度分别为7.2%、3.9%和4.0%，内标提取回收率分别在93.6%～96.3%，室温稳定性、冻融稳定性及30天稳定性考察结果均满意。　　 ICP-AES浓度在0～5mg·L-1范围内线性良好，回归方程为Y=596.9*X-14.8，相关系数r=0.9999。ICP-MS浓度在0～100μg·L-1范围内线性良好，回归方程为Y=7.035×10-3*X-2.813×10-4，相关系数r=0.9999。　　 方法学研究及验证结果表明，所建立的LC-MS/MS法简便快捷、重复性好、灵敏度高，适合于丹参酮ⅡA和靛玉红的体内药代动力学研究。ICP-AES和ICP-MS测定法适合于全血总砷的测定。　　 二、雄黄、丹参酮ⅡA和靛玉红单用在大鼠的药代动力学研究　　 本研究采用已经建立的丹参酮ⅡA和靛玉红血药浓度的LC-MS/MS测定法，研究雄黄、丹参酮ⅡA和靛玉红药代动力学，以及摄食对后两者药代动力学行为的影响。　　 24只大鼠，随机分为4组，禁食过夜或未禁食的大鼠按20mg·kg-1剂量分别灌胃丹参酮ⅡA、靛玉红混悬液，给药前及给药后0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、6、8、10、12、24、32、48和56h采血，10μL低分子肝素钠抗凝，4000rpm离心取上清，-40℃保存待测。LC-MS/MS测定血浆药物浓度，绘制血药浓度-时间曲线图，统计矩法计算主要药代动力学参数。　　 6只大鼠禁食过夜，禁食后按75mg·kg-1灌胃雄黄混悬液。分别于给药前及给药后0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、6、8、10、12、24、32、48、56、72、80、96、104、120和144h大鼠眼眶静脉丛采血0.7mL，10μL低分子肝素钠抗凝，-40℃保存待测。ICP-AES或ICP-MS测定血砷浓度，绘制血药浓度-时间曲线图。　　 禁食单一给药后，丹参酮ⅡA的药代动力学参数（n=6）为tmax=2.2±0.8h, Cmax=2.4±0.8μg·L-1，t1/2z=7.6±4.5h，AUC0-T=21.4±9.7μg·h·L-1；靛玉红的药代动力学参数(n=6)为tmax=4.2±1.0h，Cmax=3.7±0.7μg·L-1，t1/2z=4.7±2.5h，AUC0-T=22.8±8.7μg·h·L-1。　　 摄食单一给药后，丹参酮ⅡA的药代动力学参数(n=6)为tmax=5.0±2.0h，Cmax=17.4±9.0μg·L-1，t1/2z=16.8±15.1h，AUC0-T=322.0±175.3μg·h·L-1；靛玉红的药代动力学参数(n=6)为tmax=10.3±1.5h，Cmax=5.2±1.0μ.g·L-1，t1/2z=8.0±1.6h, AUC0-T=71.6±16.7μg·h·L-1。　　 单用雄黄的血砷AUC0-T为1491.9±233.6μg·h·L-1，雄黄血药浓度与基线相当，不吸收或微量吸改。　　 结果表明，摄食可显著延迟丹参酮ⅡA和靛玉红的吸收，显著提高Cmax，显著延缓和减少其消除，并显著增加其AUC，使这两药的体内暴露量增加，丹参酮ⅡA的程度更为显著，建议临床应考虑摄食对该药疗效的影响。雄黄不吸收或微量吸改，砷中毒可能性减少，但提高疗效有待进一步研究。　　 三、雄黄、丹参酮ⅡA和靛玉红联用在大鼠的药代动力学研究　　 本研究采用第二部分建立的LC-MS/MS法和ICP法测定丹参酮ⅡA、靛玉红和血砷浓度，并研究三者的药代动力学相互作用。　　 研究中丹参酮ⅡA和靛玉红的剂量均为20mg·kg-1，雄黄的剂量为75mg·kg-1。选取48只大鼠，禁食12小时，体重为（342.8±11.4）g，随机分为8组，分别为第1-5组和第3-1、4-1、5-1组。第1-5组灌胃T+I，T+I(food take)，T+A，I+A，T+I+A，于给药前和给药后0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、6、8、10、12、24、32、48和56h采血，10μL低分子肝素钠抗凝，4000rpm离心取上清，-40℃保存待测。第3-1、4-1、5-1组给于第3～5组相同药物，于给药前和给药后0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24、32、48、56、72、80、96、104、120、144h采集抗凝全血，-40℃保存直至分析。　　 血浆样本同样采用LC-MS/MS进行分析丹参酮ⅡA和靛玉红。全血砷的测定预处理采用酸消解法，进样ICP-AES/ICP-MS分析。绘制血药浓度-时间曲线图，统计矩法计算主要药代动力学参数，并采用SAS进行组间比较，采用Bootstrap法估算样本总体分布的特征。　　 禁食丹参酮ⅡA与靛玉红合用，丹参酮ⅡA的药代动力学参数(n=6)为tmax=3.0±1.7h, Cmax=3.1±0.7μg·L-1，t1/2z=5.8±4.3h, AUC0.T=29.9±13.3μg·h·L-1;靛玉红的药代动力学参数(n=6)为tmax=5·2±4·1h，Cmax=2·3±0·9μg·L-1，t1/2z=5.2±4.1h, AUC0-T=12.9±6.3μg·h·L-1。　　 摄食丹参酮ⅡA与靛玉红合用，丹参酮ⅡA的药代动力学参数(n=6)为tmax=3.7±1.5h，Cmax=44.7±25.9μg·L-1, t1/2z=10.3±1.3h，AUC0.T=411.6±152.4μg·h·L-1；靛玉红的药代动力学参数（n=6）为tm,x=7.7±2.7h，Cmax=4.2±3.9μg·L-1, t1/2z=13.3±23.8h, AUC0-T=25.3±14.8μg·h·L-1。　　 丹参酮ⅡA与雄黄合用后，丹参酮ⅡA的药代动力学参数(n=6)为tmax=3.8±2.1h，Cmax=5.7±4.3μg·L-1, t1/2z=9.6±5.8h，AUC0.T=73.1±63.9μg·h·L-1:靛玉红与雄黄合用，靛玉红的药代动力学参数(n=6)为tmax=5.8h±1.6h，Cmax=5.3±2.7μg·L-1, t1/2z=11.7±8.1h, AUC0.r=43.7±24.4μg·h·L-1。　　 三药合用，丹参酮ⅡA的药代动力学参数(n=6)为tmax=6.7±1.6h，Cmax=41.1±36.9μg·L-1，t1/2z=17.2±13.4h，AUC0.T=410.7±248.7μg·h·L-1：靛玉红的药代动力学参数(n=6)为tmax=8.7±3.3h，Cmax=6.7±2.8μg·L-1，t1/2z=8.3±2.3h, AUC0.T=66.1±19.5μg·h·L-1。　　 雄黄与丹参酮ⅡA合用、雄黄与靛玉红合用和三药合用后的血砷AUC0.T分别为1453.7±234.0μg·h·L-1;946.4±456.7μg·h·L-1和243.8±125.1μg·h·L-1。　　 结果表明：(1)合用靛玉红和/或雄黄可增加丹参酮ⅡA的Cmax、AUC，延迟达峰，减少表观分布容积，降低清除率，延缓并减少消除，对丹参酮ⅡA的影响大小排列依次为靛玉红+雄黄＞雄黄＞靛玉红；(2)合用丹参酮ⅡA和/或雄黄可增加靛玉红的Cmax、AUC，延迟达峰，减少表观分布容积，降低清除率，延缓并减少消除，对靛玉红的影响大小排列依次为丹参酮ⅡA+雄黄＞雄黄＞丹参酮ⅡA;(3)合用丹参酮ⅡA和/或靛玉红可减少大鼠体内总砷水平，对总砷的影响大小排列依次为靛玉红+丹参酮ⅡA＞靛玉红＞丹参酮ⅡA。　　 丹参酮ⅡA、靛玉红和雄黄三药合用达到与单药使用的差异最大化。　　 四、丹参酮ⅡA和靛玉红排砷作用探索研究　　 本研究采用ICP-MS法测定空白未给药组、丹参酮ⅡA和靛玉红合用组以及大剂量雄黄组的全血砷水平，观察丹参酮ⅡA和靛玉红是否可促进砷的排泄，以及雄黄吸收是否与剂量成比例。　　 研究结果表明，大鼠体内砷本底随时间推移有下降趋势。总砷的暴露水平与剂量不成比例。丹参酮ⅡA和靛玉红给药后可降低大鼠体内砷水平，有待进一步研究。