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[目 的]本课题组采用来源于大鼠内皮祖细胞（Endothelial progenitor cells,EPCs）与脂肪干细胞（Adipose-derived stem cells.ADSCs）联合自体静脉血提取的富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin,PRF）膜构建AEP-BM凝胶生物膜,将其治疗于课题组制备的糖尿病创面,观察其对创面的血管化促进作用、创面愈合末期瘢痕情况,并提供干细胞体内移植治疗糖尿病创面的连续性监控。为构建可血管化、减少瘢痕形成的临床治疗应用提供系统化技术支持。[方 法]（1）采用酶消法分离SD（Sprague-Dawley）大鼠的ADSCs和EPCs并体外培养鉴定;采用Choukroun’s等人方法从SD大鼠静脉血提取PRF,根据R.Vinaya Kumar文章中使用的压膜盒制备直径为2cm的PRF膜;（2）体外将ADSCs和EPCs联合培养建立ADSCs-EPCs干细胞体系,分组为:EPCs+EGM-2培养基组、EPCs+EPC上清组、ADSCs+EPCs上清组以及ADSC s+EGM-2培养基组,采用Matrigel管腔形成模型结合免疫荧光进行微血管化能力检测;（3）采用60%高脂饲料喂养并腹腔注射1%链脲佐菌素溶液构建雄性SD大鼠糖尿病模型;并随机抽该模型鼠和同数量的健康SD大鼠取其胰腺、肝脏、肾脏HE染色病理分析和血浆进行甘油三酯、总胆固醇和胰岛素生化指标测定;（4）将糖尿病大鼠以血糖为观测指标行随机分组,且将其和同数量健康SD大鼠构建创面,分别给予A组:健康大鼠+PBS、B组:糖尿病鼠+PBS、C组:糖尿病鼠+PRF、D组:糖尿病鼠+PRF+EPCs、E组:糖尿病鼠+PRF+ADSCs、F组:糖尿病鼠+PRF+EPCs+ADSCs治疗创面;分别于0、2、4、6、8、10、12、14、天定期观察创面肉芽组织生长情况以及创面面积记录。（5）制备稳定表达Akaluc的病毒液和稳定表达luc的病毒液分别转染至ADSCs、EPCs 和 4T-1,将转染成功三组细胞以 10000、3333、1111、370、123、41细胞数梯度分组并重复三次,在活体成像仪下拍摄细胞发光强度;再次将转染成功的ADSCs和EPCs分别注入制备成功的PRF膜内,置于糖尿病创面治疗,并在术后0、3、7、14天于活体成像仪下进行拍摄,记录细胞发光强度并绘制细胞存活曲线。（6）分别在健康大鼠+PBS、糖尿病鼠+PBS、糖尿病鼠+PRF、糖尿病鼠+PRF+EPCs、糖尿病鼠+PRF+ADSCs、糖尿病鼠+PRF+EPCs+ADSCs组治疗后第3天、第14天取创面组织固定并石蜡包埋进行切片,分别采用HE染色、CD31免疫组化和Masson染色,天狼星红染色和Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白免疫组化进行观察创面愈合过程的血管化和瘢痕形成情况。[结 果]（1）成功通过贴壁法分离培养骨髓来源的EPCs和脂肪来源的ADSCs,EPCs通过CD31免疫荧光染色和免疫双标染色呈阳性,基质胶成管实验证明EPCs具备成管能力;成功诱导ADSCs分化为成骨细胞、脂肪细胞以及成软骨细胞。成功提取PRF凝胶,且成功制备出直径为2cm的PRF膜。（2）ADSCs-EPCs体外成血管能力:通过Matrigel管腔形成模型结合免疫荧光,在倒置光学显微镜下可见EPCs+ADSCs上清组管状结构最密集,统计分析各组管状分支交叉点数量:本课题组发现EPCs+EPCs上清组分支叉点数量与EPCs+EGM-2培养基组、EPCs+ADSCs上清组和ADSCs+EGM-2培养基组均具有统计学差异（p＜0.05、p＜0.01、p＜0.001）;统计分析各组管状分支长度:本课题组发现EPCs+EPCs上清组与EPCs+EGM-2培养基组差异有统计学意义（p＜0.05）、EPCs+ADSCs上清组和ADSCs+EGM-2培养基组具有统计学差异（p＜0.001）,EPCs+ADSCs 上清组与 EPCs+EPCs 上清组、EPCs+EGM-2 培养基组差异无统计学意义。（3）成功制备2型糖尿病SD大鼠创面,病理学结果显示,与健康SD大鼠对照组比较,高脂饲养+链脲佐菌素的糖尿病SD大鼠胰岛萎缩,体积减小,数量减少,分布稀疏,形态极不规则,胰岛细胞空泡样变,数目减少,β细胞坏死凋亡;肝脏可见不同程度的肝细胞空泡变性;肾小球基地系膜增生,肥大,毛细血管扩。2型糖尿病SD大鼠与健康大鼠进行比较血脂、血糖和胰岛素,测定结果显示,高脂+链脲佐菌素的制备的2型糖尿病SD大鼠的空腹血糖（fasting blood glucose,FBG）、胆固醇（Total cholesterol,TC）、甘油三酯（Triglyceride,TG）均显著升高（p＜0.001）,空腹胰岛素（Fasting Insulin,FINS）显著降低（p＜0.001）。（4）通过大体观察和创面闭合率结果显示:在创面愈合过程中,A、B组创面干燥结痂而C、D、E、F组创面较湿润,各组均未见明显感染,并且创面愈合第14天,F组即PRF膜+EPCs+ADSCs治疗组创面均闭合,其余各对照组创面均未闭合。创面愈合率显示,从术后第2天开始F治疗组的创面愈合率明显高于其余对照组（p＜0.001）。（5）Akaluc标记的ADSCs、EPCs和luc标记的4T-1在同等条件下相比,Akaluc标记的ADSCs、EPCs的发光强度强于luc标记的4T-1（p＜0.001）;EPCs+PRF膜治疗糖尿病创面组,光学信号强度从0至14天逐渐降低,在第14天检测不到光学信号,ADSCs+PRF膜治疗组,光学信号强度在0-7天逐渐上升,在第14天同样无法信号。（6）创面愈合的第3天,通过HE染色法观察各治疗组对糖尿病创面组织血管的影响,结果发现各组均有不同炎症细胞浸润,均未见完整表皮覆盖创面,可见EPCs+PRF膜组有少量毛细血管,ADSCs+PRF膜治疗组有大量脂肪细胞和空泡,ADSCs和EPCs联合PRF膜组有较多脂肪细胞和毛细血管以及血管腔隙;本课题组进一步采用免疫组化检测血管标志物CD31（平均光密度值统计分析）,发现A组和C组、D组和E组差异无统计学意义,余组两两比较差异均有统计学意义（p＜0.05）,而F组即ADSCs和EPCs联合PRF膜组与A、B、C、D、E组比较差异有显著统计学意义（p＜0.001）。在创面愈合第14天,通过Masson染色统计分析,正常对照和糖尿病创面组组织内胶原纤维容积分数差异无统计学意义（p＞0.05）,EPCs+PRF膜和ADSCs+PRF膜治疗组差异也无统计学意义（p＞0.05）,ADSCs+EPCs+PRF膜治疗组与干细胞联合PRF膜治疗具有统计学意义（p＜0.01）,与其余各组比较差异有显著统计学意义（p＜0.001）。天狼星红染色后偏振光显微镜下分析Ⅰ型和Ⅲ型胶原比例,ADSCs和EPCs联合PRF膜组的Ⅰ型胶原与Ⅲ型胶原含量小于其他各组。通过Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白免疫组化染色定量分析Ⅰ/Ⅲ胶原蛋白比例,证明ADSCs+EPCs+PRF膜的Ⅰ/Ⅲ型胶原比例与正常对照组、糖尿病对照组、PRF膜治疗组、EPCs+PRF膜治疗组以及ADSCs+PRF膜治疗组高,具有显著性统计学差异（p＜0.001）。[结 论]（1）成功分离骨髓来源的SD大鼠EPCs以及脂肪来源SD大鼠ADSCs,证明EPCs-ADSCs上清共培养时成管能力最强,成功制备外周血来源SD大鼠PRF膜;（2）优化2型糖尿病SD大鼠模型构建方法,并成功制备SD大鼠2型糖尿病创面,发现PRF膜联合EPCs和ADSCs疗法促进糖尿病创面愈合;（3）成功获取利用慢病毒转染稳定表达Akaluc的SD大鼠ADSCs和EPCs,体内实验证明SD大鼠ADSCs和EPCs移植早期可以在PRF膜存活;（4）SD大鼠ADSCs和EPCs联合PRF膜疗法促进SD大鼠糖尿病创面早期血管化并减少瘢痕生成。