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目的在前期研究基础上,建立2型糖尿病大鼠实验平台,以PI3K信号通路为主线,以脑和肌肉中CLOCK蛋白为着眼点,通过检测针刺前后相关因子的变化规律,探讨调理脾胃针法对2型糖尿病大鼠时钟重置的分子机制。方法选择40只清洁级健康雄性SD大鼠,体重120±20g,采用随机数字表法分为10只空白组和30只造模组。在经过一周的适应性喂养后,空白组大鼠给予常规饲料,造模组给予高脂高糖饲料喂养8周。8周后,造模组大鼠禁食不禁水12小时,并按体重一次性快速地给大鼠腹腔注射链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)破坏胰腺功能。选取符合2型糖尿病成模标准的24只大鼠,按照随机数字表法随机分为模型组和针刺组,每个组12只。针刺组使用“调理脾胃针法”针刺干预,每天1次,每周5次,模型组采用相同的方法抓取、穿衣,不加任何治疗。干预一共持续4周,并且在干预过程中,记录每组大鼠昼夜固定时间的随机血糖值,并根据该值用平均血糖水平(MBG)、平均血糖的标准差(SDBG)、最大血糖波动幅度(LAGE)表示血糖波动情况。于末次针刺后将大鼠断头处死,取脑组织视交叉上核、股四头肌及血清。使用酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清胰岛素含量;使用RT-PCR技术(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)检测脑、肌肉中CLOCK及肌肉中PI3K的m RNA的表达;使用蛋白质印迹法(Western blot,WB)检测脑、肌肉中CLOCK及肌肉中PI3K的蛋白表达。此外,本研究还运用16S r DNA扩增子测序和转录组测序技术对三组大鼠粪便进行测序分析,以期拓展调理脾胃针法针刺效应的作用机制。结果实验一(1)一般情况:针刺干预后,空白组和针刺组饮水量、进食量、排尿量均低于模型组且精神状态、毛发光泽度、粪便情况均优于模型组。与空白组相比,模型组和针刺组大鼠体重较低,差异具有统计学意义(P<0.05),但针刺组大鼠与模型组大鼠体重相比无统计学差异(P>0.05)。与空白组相比,模型组和针刺组大鼠体重持续下降,但针刺组下降趋势较模型组大鼠更平缓。(2)干预前后血糖波动情况:针刺干预前,与空白组大鼠相比,针刺组和模型组大鼠的MBG、SDBG和LAGE均高于空白组,且差异有统计学意义(P<0.05)。针刺组与模型组MBG、SDBG和LAGE相比较无统计学意义(P>0.05)。干预后,与空白组相比,模型组与针刺组MBG、SDBG和LAGE仍高于空白组,差异具有统计学意义(P<0.05)。但在干预1周后,与模型组相比,针刺组MBG、SDBG和LAGE开始降低,差异无统计学意义(P>0.05);干预2周后,针刺组与模型组MBG、SDBG和LAGE比较开始出现差异,且差异具有统计意义(P<0.05)。第3周、第4周针刺组MBG、SDBG和LAGE较模型组持续降低且差异均具有统计学意义(P<0.05),提示血糖日波动幅度逐渐减小。干预期间空白组大鼠日血糖波动通常在8:00及23:00时血糖值较高,在16:00时最低,昼夜变化节律稳定且血糖值均低于模型组及针刺组。干预1周后,针刺组与模型组血糖在8:00后开始下降,14:00降至谷值后逐步上升;干预2周后针刺组与模型组日血糖波动趋势出现差异,两组大鼠血糖均在8:00后开始下降,14:00降至谷值后逐步上升,针刺组在14:00至16:00期间上升趋势明显缓于模型组;干预3周后,针刺组与模型组血糖在8:00后开始下降,模型组血糖仍在14:00降至谷值后逐步上升,而针刺组则在16:00左右血糖降至谷值后逐步上升,与空白组出现谷值时间接近;干预4周后,模型组血糖变化趋势无明显改变,针刺组与空白组血糖均在8:00后开始下降,16:00后开始上升,23:00后缓慢下降。(3)干预前后血清INS(m U/L)水平:针刺干预前,与空白组相比,模型组与针刺组的血清胰岛素水平较低(P<0.05)。干预4周后,与空白组相比,针刺组与模型组INS水平均降低。然而与模型组相比,针刺组INS水平较高,差异具有统计学意义(P<0.05)。实验二(1)RT-PCR结果:与空白大鼠相比,模型组大鼠下丘脑和股四头肌中CLOCK基因表达均降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组大鼠相比,针刺组大鼠下丘脑和股四头肌中CLOCK基因表达均上升,且差异具有统计学意义(P<0.05)。与空白大鼠相比,模型组和针刺组大鼠股四头肌中PI3K表达均下降,差异具有统计学意义(P<0.05),与模型组大鼠相比,针刺组大鼠股四头肌中PI3K相对表达量更高,且差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)WB结果:干预结束后,空白组与模型组比较,条带更宽,表达量升高(P<0.05)。针刺组与模型组比较,条带略宽,表达量升高(P<0.05)。针刺组与空白组比较,条带略细(P>0.05)不具有统计学意义。模型组与空白组、针刺比较,条带更窄,PI3K蛋白表达量明显降低(P<0.05),针刺组与空白组比较,条带略粗(P>0.05),不具有统计学意义。实验三(1)与空白组和模型组相比,模型组肠道菌群多样性降低和微生物群落结构发生改变(P<0.05)。(2)调理脾胃针法可提高糖尿病肾病大鼠肠道微生物多样性,门水平表现为增加拟杆菌门相对丰度的同时减少厚壁菌门相对丰度,降低厚壁菌门/拟杆菌门比值;属水平表现为使Lactobaci-llaceae;group_Lactobacillus、Ruminococcaceae;group_丰度下降,Prev otellaceae;group_Prevotella丰度增加,分布比例更趋近于空白组。结论1调理脾胃针法可以降低2型糖尿病大鼠血糖,改善血糖昼夜波动,增加血清胰岛素水平。2调理脾胃针法可以同步增加脑和肌肉中CLOCK及PI3K的表达,通过PI3K通路调节CLOCK来改善昼夜节律,其改善时钟重置的机制可能与此相关。3通过拓展研究发现“调理脾胃针法”可改善肠道菌群的结构,其可能与改善血糖波动的昼夜节律相关。