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背景及目的弥漫大B细胞淋巴瘤（Diffuse Large B Cell Lymphoma,DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤（Non-Hodgkin’s Lymphoma,NHL）中最常见的组织学亚型,具有高度异质性的遗传和表型特征。基因表达谱将DLBCL分为两个不同的分子亚型,即活化B细胞亚型和生发中心B细胞亚型。虽然标准一线治疗方案（R-CHOP）可以使约60%的病例获得完全和持久的缓解,但是仍有30-40%的病人出现复发,另有10%出现难治性疾病。这部分病人预后极差,治疗方案的选择也十分棘手。肿瘤免疫治疗已成为复发或难治性（Relapsed or Refractory,R/R）DLBCL重要的治疗手段,而研究表明肿瘤免疫微环境对免疫治疗疗效有着极大的影响。由于肿瘤微环境（Tumor Microenvironment,TME）在肿瘤的发生发展及复发耐药中起着重要的作用,所以TME越来越成为实体肿瘤和血液系统恶性肿瘤进展、转移和治疗耐药研究的焦点。因此,全面了解DLBCL的瘤内异质性和TME特征对于阐明驱动DLBCL进展的机制和研究新的治疗方法至关重要。材料与方法1.通过分析来自2个反应性淋巴结组织和2个DLBCL淋巴结活检组织的单细胞转录组数据探究DLBCL的瘤内异质性及IME特征。使用R包Seurat（v4.0.2）进行单细胞 RNA 测序（Single cell RNA sequencing,scRNA-seq）数据的过滤和归一化、合并与校正批次效应以及聚类和降维。分别使用R包CellChat（v1.1.3）、Monocle 2（v2.16.0）、基因集变异分析（Gene Set Variation Analysis,GSVA）和SCENIC（v1.2.4）进行细胞通讯分析、细胞轨迹分析、基因集变异分析和单细胞调控网络推理和聚类分析。2.分别从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库和基因表达综合（Gene Expression Omnibus,GEO）数据库下载DLBCL患者的基因表达谱数据和临床信息,并下载IMvigor210免疫治疗队列的基因表达谱数据和临床信息。提取基因差异表达分析得到的CD8+TExH亚群相关基因,在TCGA队列中通过Cox回归分析及Lasso回归分析筛选预后相关基因并构建预后模型,根据预后模型获得的中位风险评分,将DLBCL样本分为高风险组和低风险组,并绘制不同风险组的Kaplan-Meier曲线。绘制以1、3和5年为定义点的时间相关受试者工作特征曲线（Receiver Operating Characteristic,ROC）曲线,计算相应的ROC曲线下面积,以评估预后模型的预测准确度,通过Cox回归分析验证风险评分是否为DLBCL的独立预后指标。GSE10846队列被用作独立的外部验证队列,以验证预后模型的效能。采用ESTIMATE算法和反卷积算法CIBERSORT计算每个DLBCL样本的TME评分和免疫细胞丰度。通过基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）软件（v4.1.0）进行富集分析,以识别在高风险和低风险组中富集的通路。IMvigor210免疫治疗队列被用于评估不同风险组患者对PD-L1治疗反应的差异。采用Spearman相关性分析探究免疫检查点基因与风险评分之间的相关性。结果1.scRNA-seq分析结果（1）对包含11729个细胞的scRNA-seq数据进行降维、聚类得到12个细胞亚群,使用已知的标记基因将这些细胞分配到5种不同的细胞类型:B细胞（标记基因:MS4A1和CD79A）,T细胞（标记基因:CD3D、CD3E、CD3G和TRAC）,NK细胞（标记基因:GNLY和NKG7）,树突状细胞（Dendritic Cells,DC）（标记基因:IR7和IR8）,单核细胞（标记基因:LYZ和CD68）。B细胞和T细胞是DLBCL组织中最主要的细胞类型。（2）恶性B细胞亚群显示出高度的异质性。基因差异表达分析显示恶性B细胞亚群之间具有不同的转录特征,GSVA分析表明恶性B细胞亚群之间有着不同的分子特征。（3）肿瘤浸润性调节性T细胞（Tregs,CD4+TREG）在DLBCL组织中富集,高表达TIGIT和CTLA4等免疫抑制标志物,显示出高度免疫抑制特性;耗竭型细胞毒性CD8+T（CD8+TExH）细胞高表达LAG3、TIGIT和HAVCR2等衰竭标志物;细胞发育轨迹表明CD8+T细胞有两条分化路径:细胞毒性CD8+T细胞（CD8+TTox）和 CD8+TExH。（4）CellChat分析显示恶性B细胞亚群之间以及与其他细胞亚群之间存在着复杂的交互作用。在DLBCL组织中检测到22条重要通路,其中MIF信号通路是比较突出的传出和传入信号模式。推断的MIF信号网络的网络中心性分析表明,恶性B细胞亚群是最主要的信号来源。通过CellChat模式识别模块发现了传出信号的3种模式和传入信号的3种模式。所有恶性B细胞的传出信号的特点是模式#1,包括了 MHC-Ⅱ、MIF、MHC-I、CD22、CD45等途径;另一方面,目标细胞的通信模式表明恶性B细胞的传入信号主要由模式#1主导,其中包括CD22、CD45、CD70、BAFF、IFN-Ⅱ等信号通路,这表明恶性B细胞通信的模式同质化。2.Bulk RNA-seq 分析结果（1）提取基因差异表达分析得到的CD8+TExH亚群相关基因,在TCGA队列中通过Cox回归分析和Lasso回归分析筛选得到用于模型构建的6个预后相关基因（GABRA3,HOXC8,RTN4R,CRLF1,BIRC3,REXO5）。根据预后模型获得的中位风险评分,将DLBCL样本分为高风险组和低风险组。生存分析显示高风险组患者预后较差（P＜0.001）,1年、3年和5年OS的ROC曲线下面积分别为0.83、0.80和0.80。在外部验证队列（GSE10846）中,生存分析也显示高风险组患者预后较差（P＜0.001）,1年、3年和5年OS的ROC曲线下面积分别为0.71、0.70和0.63。单因素和多因素Cox回归分析结果均表明风险评分是DLBCL的独立预后因素。（2）基因集富集分析显示高风险组基因富集的通路包括氮代谢、氧化磷酸化、核糖体、阿尔兹海默症、帕金森病,低风险组基因富集的通路包括细胞外基质受体相互作用、局灶性黏附、缝隙链接、癌症中的通路、肌动蛋白细胞骨架的调节。（3）ESTIMATE分析显示高风险组有着更高水平的免疫和基质评分。CIBERSORT分析结果显示,7种类型的免疫浸润细胞与风险评分相关:静止CD4记忆T细胞,活化CD4记忆T细胞,调节T细胞,γδT细胞,M0、M1、M2型巨噬细胞。风险评分与免疫检查点基因的相关性分析表明,大部分免疫检查点基因表达水平与风险评分成正相关。在IMvigor210免疫治疗队列中,较高的风险评分与抗PD-L1治疗的客观反应相关。结论1.恶性B细胞亚群存在显著的异质性,CD4+TREG表现出高度免疫抑制特性。2.恶性B细胞通信的模式同质化。3.本研究所构建的预后模型具有良好的预测价值,可以对DLBCL患者预后及免疫治疗反应进行监测评估。