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背景:先天性巨结肠(Hirschsprung’s disease,HSCR)是一种多基因改变导致的遗传性先天性疾病,其基本病理特征为病变肠段神经节细胞缺失伴神经纤维排列紊乱,以致受累肠段持续异常收缩而近端结肠代偿性扩张,形成巨结肠。现已明确HSCR是一种神经嵴细胞源性疾病,多种因素均可影响神经嵴细胞的发育,其中轴突导向因子Semaphorin3(SEMA 3)家族分子是一类表达于脊椎动物的分泌型蛋白,主要通过调节突触形成、轴突修剪、树突棘的密度和成熟等来调控神经元的迁移、增殖、分化甚至凋亡。既往研究证实HSCR患者携带有SEMA 3C/3D基因罕见突变,很可能参与HSCR发病。目的:探索SEMA3C/3D突变蛋白对神经细胞轴突生长、迁移、分化和成熟的影响及其在分子水平的作用机制,进一步阐明先天性巨结肠的复杂发病机制。方法:1.分别用野生型(wild type,WT)和突变型(S329G SEMA 3C、V337M SEMA3C、H424Q SEMA3C、V457I SEMA3D、P615T SEMA3D)SEMA 3质粒转染HEK293T细胞获取含融合蛋白的上清液,经底物显色法定量后,再用含0.5nm/ml相应蛋白的野生型和突变型上清液分别处理Neuro-2a细胞1h,收集处理后的细胞先用免疫荧光染色法检测细胞骨架的形态变化,再用Transwell迁移实验检测其迁移功能,同时提取处理后的细胞总蛋白用Western blot法检测cofilin、ERM、CRMP2各蛋白表达水平及其重要位点磷酸化水平变化情况。2.建立胎鼠肠神经嵴细胞(Enteric Neural Crest Cell,ENCC)原代培养的技术方法,用含0.5nm/ml相应蛋白的野生型和突变型上清液分别处理细胞72h,再用含5%胎牛血清的促分化培养基孵育7d后,收集细胞先用特异性标志物多重免疫荧光染色法检测ENCC的分化倾向和神经元成熟度,再用Transwell迁移实验检测其迁移能力。结果:1.与WT SEMA 3D组相比,P615T SEMA 3D作用下的Neuro-2a细胞的p-cofilin蛋白表达水平明显降低(P<0.05),而其他蛋白(cofilin、ERM、p-ERM、CRMP2、p-CRMP2)的表达水平均没有统计学差异。与WT组相比,其他突变型SEMA 3C/3D作用下的Neuro-2a细胞各蛋白表达水平也没有统计学差异。2.与空载对照组相比,WT SEMA 3C/3D作用下的Neuro-2a细胞有收缩的趋势,但轴突和树突/树突棘排列整齐、结构完整;而突变型SEMA 3C/3D作用下的Neuro-2a细胞明显收缩,轴突和树突/树突棘弯曲缠绕、排列紊乱,轴突生长锥塌陷,更严重的是部分细胞骨架蛋白断裂,失去正常的细胞结构。3.与空载对照组相比,WT SEMA 3C组的Neuro-2a细胞迁移率明显增加(P<0.05),与WT组相比,突变组(S329G SEMA 3C、V337M SEMA 3C、P615T SEMA 3D)的细胞迁移率明显降低(P<0.05)。4.与空载对照组相比,WT SEMA 3C作用下的ENCC分化为神经元/成熟神经元的能力均明显增强(P<0.01);与WT相比,突变型SEMA 3C作用下的ENCC分化为神经元/成熟神经元的能力均有下降的趋势,其中以V337M SEMA 3C处理组的下降最为明显(P<0.01)。而在SEMA 3D处理组中,WT和突变型SEMA 3D作用下的ENCC分化为神经元/成熟神经元的能力均没有统计学意义上的差异。5.SEMA 3C/3D各处理组中的ENCC神经球均可以穿过Transwell小室的基底膜,其迁移能力没有明显差异。结论:1.P615T SEMA 3D可通过下调p-cofilin蛋白表达水平破坏细胞骨架蛋白,从而抑制细胞轴突生长和迁移。2.突变型SEMA 3C/3D对神经细胞轴突生长和迁移具有抑制作用。3.WT SEMA 3C促进ENCC向神经元的分化和成熟,突变型SEMA 3C抑制ENCC向神经元的分化和成熟。4.SEMA 3C/3D不影响ENCC的迁移。