间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测四种血清型鸭疫里默氏杆菌抗体的研究

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本研究针对我国鸭疫里默氏杆菌流行的几种主要血清型——血清1型鸭疫里默氏杆菌、血清2型鸭疫里默氏杆菌、血清4型鸭疫里默氏杆菌、血清5型鸭疫里默氏杆菌,应用超声波裂解法制备的裂解物作为抗原包被酶标板,成功建立了检测鸭疫里默氏杆菌抗体的间接ELISA。确定了ELISA的最适条件为:抗原的包被浓度为3.8μg/ml(血清1型鸭疫里默氏杆菌)、4.5μg/ml(血清2型鸭疫里默氏杆菌)、2.8μg/ml(血清4型鸭疫里默氏杆菌)、3.7μg/ml(血清5型鸭疫里默氏杆菌),酶标羊抗鸭IgG的工作浓度为1:4000,37℃包被时间为2小时,封闭时间为30分钟。 经交叉试验、阻断试验、重复性试验等证实建立的ELISA重复性好、特异性强。板内变异系数分别为:2.85%~9.1%(血清1型鸭疫里默氏杆菌)、6.98%~8.67%(血清2型鸭疫里默氏杆菌)、3.81%~9.83%(血清4型鸭疫里默氏杆菌)、2.68%~7.33%(血清5型鸭疫里默氏杆菌),板间变异系数分别为2.82%~6.3%(血清1型鸭疫里默氏杆菌)、4.22%~9.63%(血清2型鸭疫里默氏杆菌)、2.6%~9.01%(血清4型鸭疫里默氏杆菌)、2.37%~6.13%(血清5型鸭疫里默氏杆菌)。包被鸭疫里默氏杆菌抗原时,对鸭抗5:A多杀性巴氏杆菌阳性血清、鸭抗Ⅰ型鸭病毒性肝炎阳性血清、鸭抗鸭源大肠杆菌K88阳性血清、鸭抗鸭源肠炎沙门氏菌阳性血清、鸭抗鸭源大肠杆菌K99阳性血清、鸭抗鸭瘟阳性血清检测结果呈阴性。各血清型鸭疫里默氏杆菌抗原阻断结果阳性。间接ELISA方法的灵敏度是微量凝集试验的50-100倍(血清1型鸭疫里默氏杆菌),25-100倍(血清2型鸭疫里默氏杆菌),12-100倍(血清4型鸭疫里默氏杆菌),25-200倍(血清5型鸭疫里默氏杆菌)。 通过对20份阳性血清效价的测定,发现血清1:100倍稀释时的OD值与血清效价倒数的对数之间存在直线相关性,并据此建立了标准曲线和回归方程lg[ET(ELISATiter)倒数]=1.107+2.819x(血清1型鸭疫里默氏杆菌),lg[ET倒数]=1.019+2.935x(血清2型鸭疫里默氏杆菌),lg[ET倒数]=0.99+2.709x(血清4型鸭疫里默氏杆菌),lg[ET倒数]=1.052+2.953x(血清5型鸭疫里默氏杆菌),应用该方法对血清样品检测一个稀释度即可获得血清样品的ELISA滴度,使得大规模的血清样本定量检测变得相对简单和容易。 应用建立的间接ELISA方法,对40只用油佐剂灭活疫苗免疫后鸭子的抗体消长进行了测定,结果表明该方法适于作为疫苗免疫效果的评价。
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