猪链球菌2型MRP单克隆抗体的制备及血清抗体的检测

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应用0.8%甲醛灭活的猪链球菌2型9801全菌作为抗原,免疫BABL/C小鼠,待抗体水平达到1:100000时,取脾细胞并与对数期生长良好的SP2/0进行融合。应用亲和层析纯化的原核表达的溶菌酶释放蛋白(MRP)为抗原建立了间接ELISA筛选阳性克隆,将阳性克隆多次有限稀释(每孔约0.5~1个细胞)得到MRP阳性单克隆细胞8株。将10~5~10~7个细胞注射到BABL/C小鼠腹腔制备腹水,效价约1:10000,并用Westen-blot鉴定此单抗。应用兔源全菌抗体和MRP单抗建立双夹心间接ELISA,用于检测猪链球菌2型,试验结果证实可以区分猪链球菌2型与A群、B群、C群、D群链球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等菌株。 应用甲醛灭活的猪链球菌2型9801菌株作为标准菌株建立了检测猪链球菌2型抗体的菌体包被间接ELISA,并应用该菌的荚膜多糖提取物建立了荚膜多糖包被间接ELISA。并对两种间接ELISA方法进行了比较。试验结果显示,利用荚膜多糖包被的间接ELISA检测猪链球菌抗体虽然非特异性低,但试验结果阳性血清OD值偏小,试验方法的灵敏度降低,荚膜多糖作为包被抗原对ELISA板的要求很高,国产普通ELISA板包被效果很差;而应用菌体包被间接ELISA进行猪链球菌抗体检测,非特异性比用荚膜多糖包被间接ELISA高,但比超声波抗原的非特异性低,非特异性随着抗体稀释度的增加而逐渐减小,试验可以找到一个灵敏度与特异性均较高的稀释度,因而适用于猪链球菌2型抗体的检测。与毒力因子作为包被抗原的间接ELISA相比,菌体包被间接ELISA进行猪链球菌抗体检测还具有全面准确的特点。菌体作为包被抗原时对ELISA板的要求不高,可以降低检测的成本,在-20℃可保存一年半以上。菌体包被间接ELISA优于荚膜多糖包被间接ELISA,可用于猪链球菌的抗体监测,便于推广应用。 应用猪链球菌2型9801株菌体包被间接ELISA分别对70份阳性血清和70份阴性血清进行1:100、1:200、1:400、1:800稀释检测,制作了不同稀释度下阳性血清和阴性血清的OD值与出现频率的正态分布图,以及血清不同稀释倍数的检测结果的ROC曲线,利用血清流行病学原理对检测结果进行分析,确定了检测方法的最佳单一稀释度1:400,以及判定阳性血清和阴性血清的OD值:以OD值≥0.6为检测阳性,以OD值≤0.3为检测阴性,0.3<OD值<0.6为检测可疑值。并应用建立的方法及阳性摘要血清和阴性的判定标准,对1 997年采集的江苏地区的猪血清进行了检测.阳性率高达48%,尤其是双甸马塘地区,阳性率高达7 2.4%.而杭体阳性率高的地区也正是1998年至1 999年间江苏省首先幕发猪健球菌2型的地区,推测在98年猪链球菌大爆发的前期,有的猪场已经存在猪链球菌病感染,可能由于自身抵抗力和杭生素的作用,没有在当时就一下基发,因而及时对杭体监控是预防控制该病的重要措施.
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