作为妇科中的一种致命性强、恶性程度高的肿瘤,卵巢癌在全世界范围内每年已经造成大约有12.5万人死亡。特别是针对晚期卵巢癌而言,约30%的初次诊断后,患者仅仅只有5年的存活率。确诊就是晚期,70%晚期患者是造成卵巢癌的高死亡率的一个主要原因;另一部分重要原因在于,其中有大量病人都普遍发生对化疗药物的耐药性。因此,靶向治疗分子的筛选与研发以及通过靶向药物增强卵巢癌对化疗的敏感性是目前亟待解决科研和临床问题。通过靶点开发、药物机理和临床研究将提高卵巢癌的疗效,这将对患者预后的改善具有十分重要的价值。第一部分TIMELESS在卵巢癌细胞中的功能目的:本研究探讨TIMELESS在卵巢癌中的表达,以及在卵巢癌细胞中靶向TIMELESS对细胞增殖、凋亡、克隆形成能力及其对顺铂敏感性的作用。方法:运用生物信息学深度分析方法、卵巢癌组织芯片和免疫印迹（Western Blot,WB）检测正常对照卵巢组织、卵巢癌组织以及四种卵巢癌细胞系（A2780、HO-8910、OVCAR3、SKOV3）中TIMELESS mRNA和蛋白的表达水平;通过化学合成siRNA与脂质体共转染,在体外运用基因沉默技术敲减TIMELESS的表达,实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和Western Blot分别检测TIMELESS在卵巢癌细胞系中mRNA和蛋白水平变化;CCK-8检测敲减作用对A2780、HO-8910、OVCAR3、SKOV3细胞株增殖影响;克隆形成实验测对以上细胞克隆形成能力影响;Annexin V/7-AAD双染色法检测各组卵巢癌细胞的凋亡水平;进一步,通过Western Blot检测凋亡相关指标,如凋亡蛋白（Cleaved Caspase-3）和衰老相关指标,如衰老标志物P21;最后,采用TIMELESS siRNA与顺铂联用给药方式,通过CCK-8检测其对卵巢癌细胞的顺铂敏感性的作用。结果:1、数据库深度挖掘的生信分析和RT-qPCR显示:与正常组织相比,TIMELESS在卵巢癌患者的病理组织中的表达水平显著升高（P＜0.05）,TIMELESS的表达升高提示其在卵巢癌发生进展中可能发挥十分重要的作用;2、组织芯片结果发现TIMELESS在各种类型的卵巢癌中有53%阳性率（21/40例）;3、RT-qPCR和Western Blot检测在A2780、HO-8910、OVCAR3、SKOV3四种卵巢癌细胞系中,与正常卵巢上皮细胞相比TIMELESS在mRNA和蛋白水平表达显著升高;4、在卵巢癌细胞株SKOV3和A2780中成功证实了 2个siRNA靶点siRNA-1（siTIM 1392）和siRNA-2（siTIM 3181）在mRNA和蛋白水平都显著抑制TIMELESS的表达（p＜0.01）。5、CCK-8增殖实验和克隆形成实验结果表明敲减TIMELESS可显著抑制卵巢癌细胞的增殖能力（p＜0.01）和克隆形成能力（p＜0.05）;6、Annexin V/7-AAD双染细胞凋亡实验结果表明:与干扰对照组（siRNA NC）相比,TIMELESS敲减组的凋亡水平发生了明显升高（p＜0.05）;7、TIMELESS敲减组与对照组相比,凋亡蛋白（Cleaved Caspase-3）和衰老蛋白（p21）都上调表达（p＜0.05）;8、在增加化疗药顺铂浓度的前体条件下,siRNA NC、siRNA-1和siRNA-2三组细胞增殖均受到抑制,而细胞半数抑制浓度（IC50）均显著降低,由此在卵巢癌细胞中通过siRNA敲减TIMELESS的方法,可显著增加细胞对顺铂的敏感性。结论:在卵巢癌组织以及细胞中,TIMELESS均显示其异常高表达,提示它在卵巢癌发生发展中发挥着十分重要作用。在卵巢癌细胞中,RNAi技术沉默TIMELESS揭示TIMELESS敲减可显著抑制增殖和克隆形成能力、促进其凋亡和衰老,增进卵巢癌细胞对顺铂的化疗敏感性。第二部分TIMELESS影响卵巢癌细胞顺铂敏感性的机制探究目的:探究TIMELESS在卵巢癌细胞DNA损伤应答中的作用,探索其影响卵巢癌细胞顺铂敏感性的可能机制,为临床化疗提供新的线索。方法:通过Western Blot检测TIMELESS 敲减后A2780和SKOV3细胞中γ-H2AX 的表达水平,彗星实验检测DNA损伤水平;设计针对TIMELESS 3’-UTR区的siRNA与TIMELESS过表达质粒共转染,通过回补实验再次验证TIMELESS在DNA损伤修复中的作用;TIMELESS siRNA联合顺铂（1μg/ml）治疗后,运用Western Blot检测DNA损伤及修复相关蛋白如γ-H2AX,Rad51以及DNA损伤修复通路蛋白p-ATR,p-CHK1的变化;Western Blot检测联合作用后凋亡-衰老通路相关蛋白p53、p21的变化。结果:1、TIMELESS敲减可导致A2780和SKOV3细胞内γ-H2AX 水平上调,以及A2780细胞的彗星尾部变长、灰度增加,提示TIMELESS敲减组卵巢癌细胞内发生了较高水平的DNA损伤;2、外源性的TIMELESS表达可回复由针对TIMELESS 3’-UTR区的siRNA引起的DNA损伤;3、TIMELESS敲减同时下调了同源重组蛋白Rad51的表达,导致卵巢癌细胞DNA损伤修复功能受损;4、TIMELESS siRNA与顺铂联合作用,TIMELESS敲减组细胞ATR-CHK1通路受到抑制,抑制水平显著高于对照组,该组细胞γ-H2AX高于对照组水平,导致DNA损伤应答更敏感;5、A2780和SKOV3细胞中p21蛋白表达呈上升的趋势,且不依赖于p53途径,TIMELESS敲减组细胞p21蛋白水平高于对照组。结论:TIMELESS在卵巢癌细胞损伤应答过程中起着重要作用。在顺铂诱导DNA损伤时,TIMELESS敲减组细胞ATR-CHK1通路活化受到抑制,DNA损伤明显增加,且修复功能受损,从而促进卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。这些研究可能会提示TIMELESS在卵巢癌中的作用机制,为治疗卵巢癌提供的新的靶点,并且为改善病人预后提供创新策略。第三部分体内实验验证TIMELESS影响卵巢癌细胞顺铂敏感性目的:探索TIMELESS敲减在动物水平影响卵巢癌细胞顺铂敏感性,为临床化疗研究提供证据。方法:通过构建TIMELESS RNAi干扰慢病毒载体（sh-TIM）与病毒包装,对A2780细胞进行慢侵染、嘌呤霉素筛选获得TIMELESS敲减的稳转细胞系,通过荧光定量PCR验证mRNA表达的敲减效率;通过Western blot验证对蛋白水平的敲减效率;将TIMELESS敲减的A2780稳转细胞系构建裸鼠移植瘤动物模型,成瘤后予以顺铂皮下注射每3天/次,剂量为3mg/kg,记录生长曲线,停药1周后处死裸鼠,剥离肿瘤组织,记录肿瘤体积;WB检测ATR/CHK通路变化情况。结果:1、与对照组相比,TIMELESS敲减稳转株mRNA水平显著降低,差异具有统计学意义（P＜0.001）;2、与对照组相比,TIMELESS敲减稳转株蛋白水平显著降低,差异具有统计学意义（P＜0.001）;3、体内裸鼠模型中,TIMELESS和顺铂联合给药组裸鼠的肿瘤体积显著减小,皮下移植瘤生长速度显著低于对照组,差异有统计学意义（P＜0.001）;3、ATR/CHK通路相关蛋白均受到显著抑制（P＜0.05）。结论:我们成功构建能够在mRNA和蛋白水平敲减TIMELESS表达的卵巢癌稳转细胞株（A2780）,而TIMELESS在顺铂耐药中起着重要作用。在体内移植瘤模型中,在顺铂诱导DNA损伤时,TIMELESS敲减组细胞受到抑制,修复功能受损,从而促进卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。