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鲍是我国非常重要的海产经济贝类,皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai）是当前我国主要的养殖鲍种,商品鲍生长周期一般长达2年,制约了鲍养殖业发展和经济效益。当前皱纹盘鲍的分子遗传学研究仍然不足,与经济性状密切相关的大多数基因功能不明确,不利于相关性状的遗传改良。因此,有必要对鲍及其足部肌肉生长这一重要经济性状的分子机制进行研究,为培育快速生长的鲍鱼品系提供科学依据。本论文探讨了调控皱纹盘鲍生长性状的分子机理,包括利用RNA-Seq、miRNA-Seq以及多种生物信息学分析技术研究了影响皱纹盘鲍生长和肌肉生长的差异表达mRNA、lncRNA、miRNA和关键分子信号通路;运用基因克隆、qRT-PCR、双荧光素酶报告基因检测系统、RNAi、原核表达、GST pull down等分子生物学技术手段研究了候选基因hdh-myostatin、hdh-BMP7、hdh-miR-1984、hdh-MIRP1的功能。此外,还初步构建了适合于鲍的显微操作技术和基因编辑技术。主要研究结果如下:1.皱纹盘鲍生长性状相关mRNA、lncRNA和microRNA的研究剪取体重差异极大的皱纹盘鲍足部肌肉进行RNA-Seq和miRNA-Seq测序,一共获得11 668个mRNA转录本、2 463个lncRNA和205个miRNA,其中GDF8、BMP7 等 18 个 mRNAs,XLOC 036689等27 个 lncRNAs,hdh-miR-1984等 7 个miRNAs可能是调控皱纹盘鲍生长发育的关键候选基因。进一步利用生物信息学分析发现,mRNA、lncRNA和miRNA主要通过控制能量代谢、胰岛素信号通路、TGF-β信号通路、MAPK信号通路等来调节皱纹盘鲍的生长发育过程。2.皱纹盘鲍hdh-myostatin的克隆、表达分析及其作用机制研究克隆获得皱纹盘鲍hdh-myostatin的CDS区,全长1 470 bp,编码489个氨基酸。hdh-myostatin在皱纹盘鲍各生长发育阶段都有表达且广泛分布于不同组织。多态性分析发现hdh-myostatin的CDS区共有9个SNP位点与皱纹盘鲍生长性状显著相关,这些SNP位点可作为皱纹盘鲍生长相关标记辅助选择育种的重要候选分子标记。当成功干扰hdh-myostatin的表达后,皱纹盘鲍壳长增长量和活体增重与对照组相比显著增加,hdh-TβRI、hdh-ActRⅡB、hdh-Smad3和MHC的表达水平都在一定程度上发生响应。随后,克隆获得绿盘鲍（皱纹盘鲍与绿鲍的杂交种）df-myostatin-like的CDS区并与皱纹盘鲍hdh-myostatin进行比较。qRT-PCR结果显示,皱纹盘鲍（DD）和绿盘鲍（DF）中极大个体比极小个体myostatin表达量更低,同一年龄的DF比DD的myostatin表达量更低。综上,hdh-myostatin与皱纹盘鲍生长密切相关,它对皱纹盘鲍生长可能起抑制作用。3.皱纹盘鲍hdh-BMP7的克隆、表达分析及其作用机制克隆获得皱纹盘鲍hdh-BMP7的CDS区,全长1 251 bp,编码416个氨基酸。Hdh-BMP7在皱纹盘鲍各生长发育阶段都有表达且广泛分布于不同组织。多态性分析发现hdh-BMP7的CDS区共有4个SNP位点与皱纹盘鲍生长性状显著相关,这些SNP位点可作为皱纹盘鲍生长相关标记辅助选择育种的重要候选分子标记。当成功干扰hdh-BMP7的表达后,皱纹盘鲍最终活体重、壳长增长量、壳宽增长量和活体增重与对照组相比均显著减少。干扰hdh-BMP7一个月后,hdh-BMPRⅠ、hdh-BMPRⅡ、hdh-Smad1和MHC的表达水平与对照组相比都极显著降低。随后,我们克隆获得绿盘鲍df-BMP7的CDS区全长与皱纹盘鲍一致。qRT-PCR结果显示DD和DF中极大个体比极小个体鲍的BMP7表达量更高,同一年龄的DF 比DD的BMP7表达量更高。综上,hdh-BMP7与皱纹盘鲍生长密切相关,它对皱纹盘鲍生长可能起促进作用。4.hdh-miR-1984调控皱纹盘鲍生长性状的功能研究qRT-PCR结果显示,hdh-miR-1984在皱纹盘鲍各生长发育阶段都有表达,随着月龄的增长其表达丰度波动变化,而且hdh-miR-1984广泛分布于不同组织。双荧光素酶报告基因检测结果表明hdh-miR-1984能靶向结合于hdh-BMP7的3’UTR。Hdh-miR-1984 antagomir注射试验结果显示,antagomir试验组鲍的壳长增长量和活体增重比PBS对照组显著增加,当鲍hdh-miR-1984表达受抑制后,hdh-BMP7表达水平提高,hdh-BMPRⅠ、hdh-BMPRⅡ和MHC表达水平提高,且干扰一个月后,表达水平均差异显著。综上研究结果,hdh-miR-1984与皱纹盘鲍的生长密切相关,hdh-miR-1984可能通过抑制靶基因hdh-BMP7的表达对皱纹盘鲍的肌肉生长进行负向调控,并最终调控皱纹盘鲍的生长发育。5.皱纹盘鲍类胰岛素相关多肽hdh-MIRP1的功能初探克隆获得的皱纹盘鲍hdh-MIRP1的CDS区全长456 bp,编码151个氨基酸。hdh-MIRP1主要在皱纹盘鲍脑神经节中高表达,在其他组织中几乎不表达。多态性分析发现其CDS区有1个SNP位点与皱纹盘鲍出肉率显著相关,该SNP位点可作为标记辅助选择育种的重要标记。原核表达、GST pull down和蛋白质谱检测方法初步筛选发现hdh-MIRP1主要与82个蛋白有相互作用。此外,克隆获得绿盘鲍df-MIRP1-like的CDS区全长并与hdh-MIRP1进行比较。qRT-PCR结果显示,同一年龄的DD和DF中极大个体比极小个体鲍的MIRP1表达水平更高;同一年龄的DF比DD的MIRP1表达水平更高,进一步证实MIRP1可能积极参与鲍的生长调控。6.皱纹盘鲍显微注射和基因编辑方法的建立通过尝试和摸索,首次成功建立适用于鲍的显微注射技术。针对Nodal,采取Golden Gate法组装TALEN,将Nodal TALEN mRNA显微注射入皱纹盘鲍未受精卵,再经人工授精和检测突变,发现Nodal成功突变,表明成功构建了适用于皱纹盘鲍的TALEN介导的基因组编辑系统。同时对CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术进行探索,但并未发现突变,还需更多的试验探索。总之,这是首次关于鲍特定位点基因组编辑的研究,取得了阶段性成果。