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卵巢癌起源于卵巢或输卵管,常常转移到腹腔腹膜或大网膜上,主要在腹腔内扩散,因而不易发现,死亡率较高。已经证明顺铂能够诱导卵巢癌细胞线粒体或内质网途径凋亡。然而随着治疗时间的延长和卵巢癌的变异,顺铂的治疗效果逐渐下降。已有研究证明了线粒体膜通透性转换是化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡的关键步骤,我们在前期工作中发现靶向线粒体、诱导内质网应激可以增强卵巢癌对顺铂的敏感性。但是,由于对影响肿瘤细胞线粒体膜通透性的调控机制不清楚,阻碍了特异性靶向肿瘤细胞线粒体膜通透性转换药物的研发。已有实验研究发现,线粒体内膜蛋白酶OMA1在结直肠癌、胃癌组织中高表达,在乳腺癌中的表达却相反,提示OMA1在不同癌症中发挥着不同的功能。虽然,尚不清楚OMA1在卵巢癌中的作用,但是,最近的研究发现在线粒体解耦联剂FCCP作用下,活化的OMA1还可能通过切割DELE1,促进DELE1向胞浆释放,激活HRI和el F2α。整合应激反应通过PERK,PKR,GCN2,HRI四种激酶激活el F2α,从而整合应对来自不同刺激的应激。当多种激酶被同时激活时,会诱导CHOP等转录因子,干扰BCL2等促活蛋白的转录,激活死亡信号。最近又发现,人卵巢癌中高表达的PHB2和SLP2可能作为OMA1的上游分子在DNA转录,核信号传导,线粒体结构完整性,细胞分裂和细胞膜代谢中发挥重要作用,OMA1被认为是肿瘤细胞命运调节的关键应激蛋白酶。表明从PHB2/OMA1/DELE1途径可以进一步阐明化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡的机制。基于以上研究背景,本研究以线粒体内膜应激蛋白酶OMA1为切入点,结合体内外实验,探讨OMA1/DELE1/HRI可能协同PERK放大线粒体与内质网之间的交互作用,增加顺铂诱导的卵巢癌细胞凋亡的机制,为靶向线粒体增强顺铂敏感性提供理论与实验依据。方法:1.探究线粒体应激诱导剂FCCP对卵巢癌细胞顺铂敏感性的影响。用FCCP（2.5μM）和/或顺铂（1μg/m L）处理A2780细胞24 h,FCCP（5μM）和/或顺铂（4μg/m L）处理ID8细胞24 h。利用MTT检测卵巢癌细胞对药物的敏感性;利用Annexin V-FITC PI双染检测卵巢癌细胞凋亡;利用Western blot检测卵巢癌细胞凋亡蛋白的表达。2.探究FCCP和顺铂对卵巢癌细胞线粒体蛋白及线粒体内外膜的影响。用FCCP（2.5μM）和/或顺铂（1μg/m L）处理A2780细胞12 h,FCCP（5μM）和/或顺铂（4μg/m L）处理ID8细胞12 h。利用Western blot检测卵巢癌细胞线粒体蛋白OMA1,OPA1的表达;利用透射电子显微镜观察卵巢癌细胞线粒体嵴和线粒体膜的结构;利用JC-1染色检测卵巢癌细胞线粒体膜电势;分离线粒体和胞浆,利用Western blot检测cytochrome c在卵巢癌细胞胞浆中的表达;利用免疫荧光观察卵巢癌细胞线粒体和胞浆中cytochrome c的表达。3.检测FCCP和顺铂对卵巢癌细胞内质网应激和el F2α/ATF4通路的影响。（1）在A2780细胞中转染DELE1-HA 24 h后,用FCCP（2.5μM）和/或顺铂（1μg/m L）处理细胞6 h。利用Western blot检测卵巢癌细胞DELE1的表达;利用线粒体分离试剂盒分离线粒体与胞浆,通过Western blot检测DELE1在卵巢癌细胞胞浆中的表达;利用免疫共沉淀检测卵巢癌细胞DELE1与HRI的结合。（2）用FCCP（2.5μM）和/或顺铂（1μg/m L）处理A2780细胞6 h,FCCP（5μM）和/或顺铂（4μg/m L）处理ID8细胞6 h。利用Western blot检测卵巢癌细胞p-PERK,p-el F2α,ATF4,ATF5,CHOP的表达;利用核蛋白提取试剂盒分离细胞核与胞浆,通过Western blot检测ATF4,ATF5,CHOP在卵巢癌细胞核中的表达;利用q RT-PCR检测卵巢癌细胞ATF4,ATF5,CHOP和BCL2家族基因的m RNA水平。（3）用FCCP（2.5μM）和/或顺铂（1μg/m L）处理A2780细胞12 h,FCCP（5μM）和/或顺铂（4μg/m L）处理ID8细胞12 h。利用线粒体提取试剂盒分离线粒体与胞浆,通过Western blot检测卵巢癌细胞线粒体BAX蛋白的表达。4.探究敲减OMA1对卵巢癌细胞凋亡的影响及相应的作用机制。（1）用sh RNA敲减A2780细胞中OMA1,给予FCCP和/或顺铂刺激。利用MTT检测卵巢癌细胞活力;利用Annexin V-FITC PI双染检测卵巢癌细胞凋亡;利用Western blot检测卵巢癌细胞蛋白的表达。（2）在野生型A2780细胞和OMA1稳定敲减的A2780细胞中转染DELE1-HA 24 h后,给予FCCP和/或cisplatin刺激,利用Western blot检测卵巢癌细胞DELE1的表达。5.探究FCCP和顺铂对卵巢癌细胞PHB2、SLP2相互作用的影响。用FCCP（2.5μM）和/或顺铂（1μg/m L）处理A2780细胞12 h,FCCP（5μM）和/或顺铂（4μg/m L）处理ID8细胞12 h。利用免疫共沉淀检测卵巢癌细胞SLP2与PHB2的结合。6.体内验证线粒体应激诱导剂FCCP和顺铂对小鼠卵巢癌皮下瘤的影响。构建卵巢癌细胞ID8小鼠皮下瘤模型。腹腔注射给药两周,每天测量小鼠体重和肿瘤体积。处死小鼠后,剥离肿瘤组织。提取肿瘤组织蛋白,Western blot检测蛋白表达;提取肿瘤组织RNA,q RT-PCR检测基因m RNA水平;制备肿瘤组织切片,利用TUNEL染色检测凋亡率;利用免疫荧光观察SLP2与PHB2的结合。结果:1.线粒体应激诱导剂FCCP和顺铂均抑制细胞活力,增加细胞凋亡率,增强凋亡蛋白cleaved caspase3的表达,并且FCCP增强顺铂诱导的凋亡,提示FCCP增强了卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。2.与对照组和顺铂组相比,FCCP组以及FCCP和顺铂联合处理组中,OMA1活化,OPA1被切割,线粒体内膜嵴重构。FCCP组线粒体膜电势下降,线粒体外膜完整,cytochrome c未释放到胞浆。FCCP和顺铂联合处理组,线粒体膜电势下降,线粒体外膜损伤,cytochrome c释放到胞浆中。表明FCCP和顺铂联合处理诱导卵巢癌细胞凋亡与线粒体外膜通透性增强有关。3.与对照组和顺铂组相比,FCCP组以及FCCP和顺铂联合处理组中,DELE1被切割,并释放到胞浆与HRI结合。与对照组和FCCP组相比,顺铂组和联合处理组中p-PERK表达增加。仅在联合处理组中,el F2α磷酸化水平增加,ATF4,ATF5,CHOP m RNA水平上调,ATF4,ATF5,CHOP入核增加,MCL1 m RNA水平下调,BIM,PUMA,NOXA m RNA水平上调,BAX在线粒体堆积。提示DELE1/HRI促进PERK诱导的el F2α/ATF4信号,诱导BCL2家族基因表达失衡。4.与FCCP和顺铂联合处理相比,敲减OMA1后,A2780细胞活力上升,凋亡率下降,OPA1和DELE1切割减少,p-el F2α,ATF4,ATF5,CHOP表达降低,cytochrome c释放减少。提示敲减OMA1通过减弱卵巢癌细胞线粒体应激和el F2α/ATF4信号逆转凋亡。5.与对照组和顺铂组相比,FCCP组以及FCCP和顺铂联合处理组中,与SLP2结合的PHB2减少。提示在卵巢癌细胞中,干扰PHB2/SLP2复合物可能激活OMA1。6.在小鼠卵巢癌皮下瘤中,线粒体应激诱导剂FCCP联合顺铂激活OMA1,切割OPA1,增加p-el F2α,ATF4,ATF5,CHOP的表达以及ATF4,ATF5,CHOP的入核,上调Atf4,Atf5,Chop m RNA水平,从而下调Mcl1 m RNA水平,上调Bim,Puma,Noxa m RNA水平,最终诱导细胞凋亡,抑制皮下瘤的生长。提示FCCP联合顺铂通过诱导凋亡抑制卵巢癌在体内的生长。结论:1.FCCP活化的OMA1通过切割OPA1诱导卵巢癌细胞线粒体内膜嵴重构,还可能同时切割DELE1激活胞浆HRI与内质网相关蛋白激酶PERK协同增强el F2α/ATF4信号,共同增加卵巢癌细胞线粒体膜通透性。2.线粒体应激通过PHB2/SLP2复合物调控OMA1/DELE1/HRI作用是核-线粒体互作放大整合应激反应增加卵巢癌顺铂凋亡敏感性的主要机制。3.体内外实验表明线粒体应激诱导剂FCCP激活PHB2/OMA1/DELE1途径能够增加卵巢癌对顺铂的敏感性。