论文部分内容阅读
目的建立SD大鼠饮水氟暴露模型,探讨子代氟暴露大鼠肠道微生物群落结构和粪便代谢谱的改变,鉴别氟暴露对机体脂代谢紊乱的影响。方法1.SD大鼠饮水氟中毒模型的构建购买成年健康SPF级Sprague-Dawley（SD）大鼠构建饮水氟暴露模型,适应性喂养一周,随机分为低剂量染氟组（10 mg/L Na F）、中剂量染氟组（50 mg/L Na F）、高剂量染氟组（100 mg/L Na F）和对照组（纯水）。同组大鼠雌雄合笼喂养,直至雌鼠怀孕。子代鼠在第21天断乳,之后接受和亲代相同的染毒处理,3月龄时麻醉处死,拍摄大鼠牙齿照片,收集腹主动脉血和结肠内容物。2.氟暴露对大鼠肠道微生态和代谢组结构的分析子代高剂量染氟组氟斑牙大鼠（Dental fluorosis group,DFG）6只、无氟斑牙大鼠（Non-dental fluorosis group,NFG）3只和对照组10只大鼠（Control group,CG）的粪便样本（每只大鼠取3份粪便样本）用于组学分析。其中一份粪便样本,使用CTAB/SDS法提取粪便样品总基因组DNA,针对16S r DNA V3-V4进行聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）扩增和Illumina Nova Seq测序技术,分析大鼠肠道菌群结构组成。另2份粪便样本分别使用亲水性和疏水性物质提取方法获得亲水性和疏水性物质,应用液相色谱-质谱联用技术对大鼠粪便代谢物进行定性定量分析,基于京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes,KEGG,http://www.genome.jp/kegg）数据库对差异代谢物进行通路富集分析,P＜0.05认为通路显著富集。3.SD大鼠和人群中血脂指标的检测取低、中、高剂量染氟组和对照组大鼠（每组雌雄各10只）血浆,使用全自动生化分析仪分析血浆中血脂指标—甘油三酯（Triglyceride,TG）、胆固醇（Cholesterol,CHOL）、低密度脂蛋白胆固醇（Low-density lipoprotein-cholesterol,LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（High-density lipoprotein-cholesterol,HDL-C）的含量。以课题组2017年在河南省开封市通许县饮水氟暴露地区调查招募的当地出生或居住5年以上的18～60岁居民为检测对象。利用氟离子选择电极测定调查对象晨尿中尿氟浓度,使用体重身体脂肪测量器测量受试者身体脂肪率、基础代谢和内脏脂肪指数,应用全自动生化分析仪测定血清中TG、CHOL、LDL-C和HDL-C水平。4.统计分析使用Illumina Nova Seq测序平台对16S r DNA基因的V3-V4区进行扩增、测序,利用QIIME软件处理测序原始数据,应用R软件和Graph Pad Prism作图。采用OPLS-DA模型筛选差异代谢物,差异代谢物筛选标准为,差异倍数≥2或≤0.5,且VIP≥1。使用Epidata 3.0软件建立数据库,并应用SPSS 21.0软件进行统计检验,定量资料采用t检验,定性资料应用卡方检验,阈值分析和回归模型分析人群中氟暴露浓度与脂质指标水平的关系。检验水准α=0.05。结果1.氟暴露对子代大鼠肠道微生态的影响高剂量染氟组大鼠（DFG和NFG）与对照大鼠肠道菌群Alpha多样性和Beta多样性无差异,肠道群落结构无差别。组间差异物种分析发现,在属水平上,DFG中鉴定出20个差异细菌;NFG中鉴定出16个差异细菌,其中8个差异菌属在DFG和NFG中均存在差异。对测序数据中菌群基因进行PICRUSt功能预测发现,DFG中菌群基因注释的差异通路有能量代谢、蛋白质输出、蛋白骨架、丙氨酸代谢、脂代谢（脂质代谢、初级胆汁酸生物合成、次级胆汁酸生物合成）、其他次生代谢物的生物合成。NFG中菌群基因注释的差异通路有:黄酮和黄酮醇的生物合成、减数分裂-酵母、昼夜节律-植物、咖啡因代谢、类固醇生物合成、线粒体中的脂肪酸延伸（P＜0.05）。2.氟暴露对子代大鼠粪便代谢谱的影响粪便代谢组学分析显示,氟暴露可致大鼠肠道代谢谱改变,OPLS-DA显示,DFG和NFG代谢物组成和含量显著不同。在DFG中共鉴定出226个差异代谢物,NFG中共筛出119个差异代谢物,这些代谢物主要为氨基酸及其代谢产物、甘油三酯类、有机酸及其衍生物、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰乙醇胺、胆汁酸、脂质等。将两组差异代谢物进行KEGG功能注释发现,DFG中生热作用、胆固醇代谢、脂肪细胞内脂解的调节、脂肪的消化与吸收、维生素的消化与吸收、胰岛素抵抗和甘油酯代谢通路发生显著富集。NFG中甘油磷脂代谢、胰腺癌、Fcγ介导的吞噬作用、促性腺激素信号通路和磷脂酶D信号通路发生显著富集（P＜0.05）。3.氟对SD大鼠和人群中血脂指标的影响对低、中、高剂量染氟组和对照组子代大鼠血浆血脂四项指标进行检测发现,在雌性大鼠中,中剂量染氟组CHOL、HDL-C含量较对照组高（2.01±0.18 vs1.41±0.15 mmol/L;1.07±0.09 vs 0.81±0.07 mmol/L）;雄性大鼠各染氟剂量组血浆脂质指标与对照组相比无统计学差异（P＞0.05）,但中剂量染氟组较高剂量染氟组CHOL、HDL-C含量高（1.79±0.06 vs 1.50±0.12 mmol/L;0.86±0.04 vs0.69±0.05 mmol/L）。女性人群中,氟暴露组较对照组血清CHOL、LDL-C（4.88±0.95 vs 4.67±0.82 mmol/L;3.22±0.84 vs 3.02±0.74 mmol/L）水平升高（P＜0.05）,且LDL-C含量与氟暴露水平存在阈值效应。结论1.过量氟暴露可致大鼠肠道细菌组成发生改变,其中益生菌、短链脂肪酸产生菌、牙周感染菌丰度下调,与肥胖相关的菌属丰度上调,脂代谢相关通路改变;粪便代谢谱组成和含量改变,差异代谢物主要富集在甘油酯代谢、脂肪的消化与吸收、胆固醇代谢等脂代谢相关通路上。2.氟暴露可影响大鼠和人群中血脂指标的含量。女性人群中,氟暴露浓度与低密度脂蛋白胆固醇水平存在阈值效应。