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[背景]家族性良性慢性天疱疮又称 Hailey-Hailey 病（Hailey-Hailey Disease,HHD）,是一种常染色体显性遗传的角化性皮肤病（OMIM 16900）。临床表现主要为,在颈项、腋窝和腹股沟等皮肤皱褶部位的红斑基础上反复出现的聚集性水疱,易出现糜烂、渗出及角化。2001年,ATP2C1基因被证实为HHD的致病基因。到目前为止,已报道的ATP2C1基因致病突变位点共有184个。在以往的研究中,Sanger测序是检测HHD患者突变的主要方法,然而在12%-55%的HHD患者中没有发现ATP2C1基因上的突变,是Sanger测序局限性导致还是有新的致病基因有待进一步证实。随着全外显子组测序技术在基因研究中的广泛应用,该技术已被证明在发现新的基因和突变方面具有重要的意义,因此我们对Sanger测序未检测到突变的患者进行全外显子测序,以期发现新的致病基因。[目的]系统分析52例HHD患者的临床特征并开展病因学检测,发现ATP2C1基因的新致病突变,扩充基因突变数据库;应用全外显子测序技术验证Sanger测序未检测到突变的患者以发现新的致病基因。[方法]本研究包括52例HHD患者和364例健康对照者。提取患者和对照者的外周血DNA。通过PCR技术扩增52例HHD患者的ATP2C1基因所有的28个外显子及侧翼序列,然后进行Sanger测序,并对未发现突变的患者进行全外显子测序。首先用DNA含量0.6ug以上的样本建库,超声破碎后获得150～200bp基因组DNA片段,修复DNA片段的末端,并在片段的两端添加Illumina接头。质检合格后,在Illumina NovaSeq 6000平台进行大规模的平行测序。对测序结果进行滤过后,与人类基因组hg19对比,用ANNOVAR工具注释其对蛋白质序列或剪接的影响,并用公共突变数据库估计其在正常人群中的变异频率。若仍未发现变异,用200位正常受试者的数据构建CNV分析基线,使用Cnvkit和ADTEx软件以基线为参考执行CNV测试目标区域,以检测是否有大片段的缺失或插入。用Pearson’s卡方检验进行统计分析。[结果]1.本研究共纳入52例HHD患者包括35名男性患者和17名女性患者,其中29例是有家族史的HHD患者,16例是散发HHD患者,另有7例情况不详,平均年龄47.7±10.5,平均发病年龄是30.1±10.7;对照组共包括364例健康正常人,男性197人,女性167人,平均年龄44.8±10.9。2.对52例HHD患者进行ATP2C1基因的Sanger测序,在41例患者中检测到41个突变,包括26个新发现罕见突变:（a）c.134G＞A,（b）c.215G＞A,（c）c.225insT,（d）c.428G＞C,（e）c.520C＞G,（f）c.757-2A＞G,（g）c.926G＞A,（h）c.935delT,（i）c.1043insTT,（j）c.10951096delAT,（k）c.1123-1G＞A,（1）c.1342A＞T,（m）c.15061509delTACT,（n）c.1568insA,（o）c.1660G＞T,（p）c.16701671delCA,（q）c.1712G＞C,（r）c.1741G＞A,（s）c.1754delG,（t）c.1939A＞G,（u）c.1943A＞T,（v）c.2058delG,（w）c.2206G＞A,（x）c.2244-1G＞A,（y）c.2500insT 和（z）c.2630-2A＞G和 15 个已知突变（a’）c.163C＞T,（b’）c.335delT,（c’）c.366T＞A,（d’）c.832G＞A,（e’）c.1024+1G＞A,（f’）c.1042T＞C,（g’）c.1045delT,（h’）c.1402C＞T,（i’）c.1414-2A,（j’）c.1720C＞T,（k’）c.1933G＞A,（1’）c.2127+1G＞A,（m’）c.2132T＞G,（n’）c.23032304delAC和（o’）c.2468C＞A,剩余11例患者未检测到突变,突变率为78.8%。新发现的突变在健康对照和公共突变数据库中均未发现,且通过PolyPhen-2和SIFT评估可能会影响蛋白质功能。3.对11例未检测到突变的HHD患者和364例健康对照者进行全外显子测序,在6例患者的ATP2C1基因上发现了 6个新的罕见突变,包括1个错义突变c.1714C＞G,2个无义突变c.358C＞T和c.2560G＞T,3个剪接位点突变c.757-2A＞G,c.1219-1G＞A和c.1308+1G＞C,这些突变在健康对照和公共突变数据库中均未发现,且通过SIFT和PolyPhen-2评估可能会影响蛋白质功能;剩余5例HHD患者中,1例患者在ATP13A5上检测到2个变异,还有4例HHD患者经过Sanger测序和全外显子测序后,未发现突变,其中1例患者在ATP2A2（毛囊角化病的致病基因）上检测到1个突变。4.仅使用Sanger测序,检测到41例HHD患者携带ATP2C1基因的突变位点,突变率为78.8%,应用全外显子测序后,又发现了 6个位于ATP2C1基因上的突变,突变率达到了 90.4%。再考虑到1例患者在ATP13A5基因上检测到突变,总的突变率达到了 92.3%,突变率明显提高。[结论]本研究通过Sanger测序和全外显子测序对52例HHD患者进行突变检测,发现48例患者携带致病突变,突变率为92.3%,远高于既往报道,证实了全外显子测序在单基因遗传病突变位点检测方面的效能,为HHD的产前诊断和遗传咨询提供了理论依据。而既往报道HHD突变率低的原因可能是:Sanger测序技术的局限性及测序仪器的精确性,人为误差和有其他致病基因存在。本研究发现32个位于ATP2C1基因的新的致病突变,丰富了突变数据库,为HHD的致病机制研究提供了理论依据。本研究也提示ATP13A5基因可能与HHD有关联。下一步的研究重点应放在ATP2C1基因和ATP13A5基因在HHD发病机制中的作用。