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双组分调控系统(Two-component Regulatory System)在致病菌的生长及毒力调控中起重要作用。本研究克隆了溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HY9901株组氨酸激酶KdpD和反应调控因子KdpE的全长基因,并对其进行生物信息学分析。序列分析结果显示,kdpD(GenBank登录号:KJ544668)全长1374 bp,共编码457个氨基酸;kdpE(GenBank登录号:KJ476728)全长732 bp,编码243个氨基酸。构建KdpD和KdpE的系统进化树,结果显示溶藻弧菌KdpD和KdpE与坎氏弧菌(V.campbellii)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)相应蛋白有较近亲缘关系。利用SWISS-MODEL软件,对KdpD/KdpE中两个相对保守的功能域HATPase_c和REC进行同源建模。本研究采用Overlap PCR和同源重组技术,结合正负向筛选,构建三株无标记基因框内敲除突变株:ΔkdpDE、ΔkdpD和ΔkdpE,比较突变株和野生株HY9901在生长速率、胞外蛋白酶活性以及毒力等方面的差异。结果显示双组分调控系统KdpDE对溶藻弧菌的生长曲线和胞外蛋白酶活性的影响不明显,但是突变株的泳动能力和生物被膜形成能力出现下降。斑马鱼致病性实验结果显示,突变株ΔkdpDE的毒力下降了78.5倍,突变株ΔkdpD的毒力下降8.84倍,ΔkdpE的毒力下降19.6倍,这证实减毒株构建成功。本研究分析了突变株在水体中的存活情况,菌体浓度在106 CFU/mL条件下,14 d后水体基本检测不到突变株;最后考察了其在鱼体内的存活情况,注射免疫7 d后,鱼体内不能检测到该菌,表明该疫苗候选株是比较安全的。以突变株ΔkdpDE,ΔkdpD和ΔkdpE为抗原,分别用注射和浸泡的方式免疫斑马鱼,免疫后第28天用溶藻弧菌和哈维氏弧菌攻毒,评估该突变株及不同免疫方式对斑马鱼的保护效果。实验结果表明,免疫后的斑马鱼能够抵抗溶藻弧菌的感染,其中注射组的免疫保护率分别为73.3%、76.7%和83.3%,浸泡组的免疫保护率为60.0%、63.3%和66.7%;同时,该突变株能刺激斑马鱼对哈维氏弧菌产生交叉保护效应,其中注射组的免疫保护率为55.2%~65.5%,浸泡组为48.8%~55.2%。以上结果表明,kdpDE基因敲除突变株可能是有效抵抗溶藻弧菌感染的减毒活疫苗候选株。