外泌体（exosome）是细胞释放的纳米级囊泡,是细胞间信息交流的重要介质。牛乳外泌体是奶牛健康状况和管理水平潜在的生物标记物,同时也在疾病的治疗和药物递送载体等方面具有重要作用,是当前奶牛生产、健康、人体健康及医学相关领域的研究热点。效果明确效率适宜的外泌体分离方法是实验室进行外泌体相关研究的前提和基础,尽管目前外泌体的分离方法较多,而国际细胞外囊泡协会也明确将密度梯度离心法（density gradient centrifugation,DGC）纳入外泌体分离,但是,很多最新的研究仍然只使用差速离心（differential ultracentrifugation,DUC）进行外泌体分离,这种做法简化了分离流程、提高了分离效率,但是否会影响所得外泌体的纯度有必要明确。同时,目前已知牛乳中存在形态特征、组成成分和生物学功能差异明显的两类纳米级囊泡,外泌体和微囊泡,并已发现尿液、血浆及肿瘤细胞等生物样本中存在大小不同的外泌体亚型。但牛乳外泌体是否存在不同亚型,还未见报道,此方面信息的缺乏会限制人们对牛乳外泌体结构、组成及生物学功能的全面认识。基于此,本研究利用实验室前期已经确定效果的凝乳酶去除乳中大部分酪蛋白后,比较了直接使用D UC和使用DUC结合DGC优化法对乳外泌体分离效果的影响,在建立一套实验室适宜高效的外泌体分离方法的基础上,结合尺寸排阻色谱法（size-exclusion chromatogr aphy,SEC）进行乳外泌体亚型分离、表征和蛋白质组分析,以期为进一步阐明牛乳外泌体的组成和生物学功能奠定基础。研究结果如下:（1）DGC处理后牛乳外泌体富集在20%、25%、30%的密度层中,对应的密度为1.127-1.199 g/m L。将分离方法优化所得的20%、25%、30%三个密度层的外泌体合并后进行分析。结果表明,与直接使用DUC法相比,DUC结合DGC优化法分离所得外泌体,粒径峰度明显收窄,透射电镜图背景更为干净,蛋白条带数目明显减少,外泌体的标记蛋白TSG101和CD63显著富集,颗粒蛋白比和脂质蛋白比显著提高（P＜0.01）。（2）从牛乳外泌体中分离出粒径分布主要在129 nm的大型（L-Exo）、85 nm的中型（M-Exo）和58 nm的小型（S-Exo）三种牛乳外泌体亚型,透射电镜图显示三种亚型均具有典型的外泌体结构,M-Exo的蛋白含量、粒子浓度及脂质含量均显著L-Exo和S-Exo（P＜0.01）,TSG101在M-Exo中的相对表达量高于L-Exo与S-Exo,但差异均不显著（P＞0.05）,CD63在S-Exo与L-Exo中的相对表达量均显著高于M-Exo（P＜0.01）,且S-Exo中CD63的相对表达量高于M-Exo,但差异不显著（P＞0.05）。（3）对中型牛乳外泌体亚型进行蛋白质组学分析,使用LS-MS/MS共鉴定出390种蛋白,这些蛋白的亚细胞定位主要定位于细胞内、细胞质、膜和亚细胞器等。三次重复试验共同鉴定到的蛋白有165种,这些蛋白的GO注释和KEGG通路分析表明,中型牛乳外泌体的主要参与体内的代谢过程,也参与一些炎症反应和免疫调节。并且,中型牛乳外泌体蛋白质组在KEGG通路分析中显著富集的通路与当前基于牛乳外泌体异质性群体的蛋白质组的富集通路不完全相同。综述,本研究利用DUC结合DGC优化法可以提高牛乳外泌体的分离效果,牛乳外泌体中存在不同大小亚型,按粒径将其分为L-Exo（＞120 nm）、M-Exo（80 nm左右）、S-Exo（＜60 nm）,且不同亚型在大小、蛋白含量、粒子浓度、标记蛋白表达量、脂质含量差异显著,M-Exo中的蛋白质主要是与体内的代谢、炎症反应和免疫调节相关。