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ZIKA病毒是一种蚊媒传播的黄病毒,自2007年起在全球范围内相继发生了几起大规模的ZIKA病毒感染的疫情,尽管大多数患者病毒感染症状较轻,但依然有部分案例证明ZIKA病毒感染与胎儿小头畸形、格林巴利综合症有关,已成为国际关注的公共卫生事件。目前ZIKA病毒感染既没有有效治疗的方法,又没有供临床使用的疫苗。因此应对ZIKA病毒感染的策略主要集中在预防感染,研发一种安全有效的疫苗此时就显得格外重要。包膜糖蛋白即E蛋白,是ZIKA病毒三种结构蛋白之一,其生物学功能是参与受体的结合、膜融合以及宿主免疫识别的主要成分。E蛋白常作为开发针对ZIKA病毒感染的保护性抗体时的靶向蛋白。本实验的目的主要是表达纯化ZIKA病毒E蛋白,并用特异性抗体检测蛋白是否具有免疫原性。扩增E蛋白膜外区基因并克隆到原核表达载体pET-28a上,成功构建了原核重组质粒pET-28a-ZIKA-E80,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,蛋白以包涵体的形式表达在沉淀中。先用8M尿素对包涵体进行变性后,再镍柱亲和层析纯化变性蛋白,得到纯度较高的重组蛋白,后又通过浓度梯度透析法缓慢去除变性剂使蛋白复性。用纯化后的重组蛋白作抗原,用针对E蛋白的特异性抗体作一抗,进行Western-blot检测,结果显示纯化蛋白具有免疫原性。膜前体蛋白即prM/M蛋白,是ZIKA病毒另一种结构蛋白,目前已知生物学功能是E蛋白前期加工运输时防止过早融合,后期帮助E蛋白折叠形成同型二聚体。prM/M蛋白在ZIKA病毒疫苗研制过程中常被作为抗体激活表位。本实验主要是选择合适的M蛋白编码序列进行原核质粒构建,并对表达的ZIKA病毒M蛋白进行纯化。先扩增全段M蛋白基因并整合到原核表达载体pET-28a上,成功构建了原核重组质粒pET-28a-ZIKA-M,但发现这一重组质粒无法在大肠杆菌中表达M蛋白,后又以此质粒为模板PCR扩增去除编码M蛋白跨膜区的序列,最终成功构建重组质粒pET-28a-ZIKA-M90,转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后,蛋白以包涵体的形式表达在沉淀中。采用与E蛋白同样的纯化方法最终得到了纯的ZIKA病毒M蛋白。本实验首先将含有编码ZIKA病毒prM/E蛋白序列的真核重组质粒pCMV-S-ZIKA_ME转染到小鼠肌肉组织中,用肌肉组织作蛋白样,以E蛋白的特异性抗体为一抗,进行Western-blot检测,结果显示重组质粒pCMV-S-ZIKA_ME在肌肉细胞中能够表达抗原蛋白prM/E蛋白。然后用PEI作免疫佐剂,采用雾化的方式将质粒pCMV-S-ZIKA_ME免疫小鼠,三次免疫后对小鼠摘眼球取血,并以纯化的prM/E蛋白作抗原,以小鼠血清作抗体进行Western-blot反应,最终结果显示小鼠血清具有特异性抗体,初步说明重组质粒pCMV-S-ZIKA_ME在体内表达后能引起机体的免疫反应。