植物雄性不育的利用使水稻、高粱、油菜等作物杂交种子的大量生产成为可能,而细胞质雄性不育既是作物杂种优势利用、轮回选择和群体改良的工具,又是研究花粉发育、细胞质遗传和核质互作的重要材料。尽管目前玉米主要采取人工去雄的方式进行杂交种子生产,但是随着人工成本的不断增加,许多大型种子企业开始采用不育化制种。在玉米的三种不育胞质类型中,C型胞质是生产上一种常用的不育类型。课题组前期对玉米C型胞质雄性不育恢复基因Rf4进行了克隆,该基因包括SBP和ANK两个功能域。为阐明恢复基因Rf4的生物学功能,本研究构建了玉米雄穗不同发育时期的cDNA文库,并利用酵母双杂技术对Rf4两个功能域的互作蛋白进行筛选,主要研究结果如下:1、通过提取玉米雄穗的RNA,反转录为cDNA,利用SMART技术,构建了玉米雄穗的cDNA文库。将cDNA文库克隆到pGADT7质粒载体中,构建了用于酵母双杂交的玉米雄穗不同发育时间的混合样品全长cDNA文库,初始文库的滴度为1.08×10¹¹ cfu/ml,库容量为1.08×10⁷cfu,空载率为0%,菌落PCR鉴定插入片段平均大小在1.0kb以上。涂板检测发现cDNA文库菌液没有污染,说明该cDNA文库能够满足筛选目的蛋白及保存的需要。2、以Rf4基因全长为模板,通过PCR扩增、回收、酶切、连接等步骤将两个功能域SBP和ANK与酵母双杂交的诱饵载体pGBKT-7连接,得到诱饵质粒SBP-BK和ANK-BK。测序验证后,与BK空载分别转入酵母Y2H菌株,并在SD缺陷型培养基上进行毒性和自激活的验证。结果发现,在SD/-Trp培养基上,转入空载和转入SBP-BK诱饵载体的菌落在大小和数目上没有明显的差别,说明诱饵蛋白没有毒性;而转入ANK-BK诱饵载体的菌落比空载的明显变小,说明诱饵蛋白有毒性,不能开展后续的试验。而在SD/-Trp/-His/-Ade培养基上,没有菌落生长,说明载体没有自激活现象。3、利用Yeast Mating的方法,对功能域SBP进行文库筛选,在SD选择性培养基上的筛选,通过AUR1-C、ADE2、HIS3、MEL1四个报告基因的表达,共得到44阳性克隆。在NCBI上进行蛋白的功能预测及分析,根据测序结果与生物信息学分析后确定了4个可能的候选蛋白。分别为线粒体膜蛋白Tom40、ACP合成酶、TCP-1伴侣蛋白以及促进ATP酶活性的伴侣蛋白。