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莲子中含有促进健康的营养成分,其提取物(EFSENN)具有抗氧化和清除自由基活性。然而,对新鲜莲子壳(FSENN)中黄酮类物质的抗氧化活性、抗肿瘤活性及其结构鉴定鲜见报道。本研究的主要目的是鉴定莲子壳60％甲醇提取物(EFSENN)中的抗氧化活性组分,并鉴定其中一个组分中的黄酮类物质,了解其结构和抗肿瘤活性。在这里,结合了现代分析技术、生物技术以及分子生物学来研究从EFSENN分离得到的黄酮类物质的结构和生物活性。主要结果如下:
1.黄酮提取和FSENN中的组分
用60％的甲醇溶液从2000g莲子壳中可以得到25g提取物(EFSENN),EFSENN用Toyopearl HW-40S进行分级,得到三个组分,分别为Fr1(130 mg),Fr2(1.8 g)和Fr3(200 mg)。采用Folin-Ciocalteu方法来测定组分中总酚的含量,Fr3中的总酚含量(相当于872.87mg没食子酸/g)比Fr2和Fr1高,其分别为768.11和138.75mg没食子酸/g。
2.鉴定EFSENN中Fr2的黄酮苷元种类及其含量
利用HPLC-UV来确定从EFSENN分离得到Fr2中的苷元组成:通过与已有的标准品比对,可以知道Fr2中含有四种苷元,分别为杨梅黄酮,槲皮素,山奈酚和异鼠李素；通过制作标准曲线来测定这四种苷元在Fr2中的含量,其中槲皮素(10.2mg/g干重)高于异鼠李素(6.2 mg/g干重),其次是山奈酚(2.8 mg/g of干重)和杨梅黄酮(0.4 me,/g干重)。
3.LC/UV/MS分析
利用LC/UV/MS在线分析Fr2中的黄酮的成分。在负离子模式下得到的有效信息,包括分子量、苷元以及糖基组成,进而分析得到六种糖基化组分。通过以下信息可以推断出峰1为杨梅黄酮-脱氧己糖:其准分子离子峰m/z[M-H]-为479,苷元离子峰m/z[A-H]-为316.9,A环碎裂为碎片离子m/z150.9和其他碎片离子270.9两部分。通过与芦丁标准品对照可以推出峰2是芦丁(609 m/z)。峰3是槲皮素.脱氧己糖,其准分子离子峰m/z[M-H]-为463,而其二级质谱峰为at m/z300.9。通过以下信息可以推断出峰4是山奈酚.单六碳糖.单六碳糖:其m/z[M-H]-为593,而二级质谱m/z[A-H]-为285。峰5为异鼠李素-单六碳糖-单六碳糖,其准分子离子峰m/z[M-H]-为623,而二级质谱[A-H]-315的进一步碎片离子为m/z270.9和m/z254.9。通过分子离子峰m/z[M.H]-为477,以及碎片离子m/z[A-H]-为315和A环裂解的两个碎片离子m/z150.8和m/z270.9,可以推断出峰6为异鼠李素.脱氧己糖；通过分子离子峰m/z[M-H]-301,以及其二级碎片离子m/z178.9、m/z150.8和m/z106.9可以推出峰7为槲皮素。
4.EFSENN中组分的抗氧化活性
通过DPPH自由基清除实验、β-胡萝卜素漂白方法分析、铁离子还原实验和总抗氧化能力的测定等体外抗氧化(T-AOC)实验来评价其抗氧化活性。采用CuSO4-Phen-Vc-H2O2-DNA化学发光法测定组分在抑制DNA氧化损伤的作用；在体外,通过化学发光方法测定组分清除羟基自由基(CuSO4-Phen-Vc-H2O2 system)和过氧化氢(luminol-H2O2 system)的能力；比较分析得出,Fr3清除DPPH自由基的能力最大,其在β-胡萝卜素漂白实验中显示出最强的抗氧化能力,然后依次是Fr2和Fr1；从我们的实验结果中可以得知,这几个组分都有显著的使铁离子还原成亚铁离子的能力；组分的总抗氧化能力从32.4到113.4U/mg,其中以Fr2的最强；其次是Fr3和Fr1；结果显示Fr3在抑制DNA损伤作用的能力比Fr2和Fr1高,其IC50分别为5±0.85,8.3±0.09和46.2±0.13μg/mL:Fr2清除羟基自由基的IC50(40±0.14μg/mL)是最小,依次是Fr3和Fr1；在清除过氧化氢实验中,Fr2和Fr3的能力相同(0.62μg/mL)。
5.体外抗肿瘤活性研究
Fr2的体外抗肿瘤活性是通过MTT法来测定组分对HeLa细胞的毒性作用,然后通过流式细胞仪和免疫印迹等来确定其抗肿瘤活性,MTT结果表明样品存在良好的剂量.效果关系,其IC50μg/mL,为50μg/mL,在样品浓度为200μg/mL时,能最大抑制细胞生长(>90％)。用浓度为150μg/mL的样品处理细胞,其G2/M分裂期递增15.96±0.59％。与对照组的G1浓度降低相比,用Fr2处理过的细胞其G2/M分裂期呈现递增趋势。这些结果表明Fr2中的黄酮类物质经由G2/M分裂期来抑制细胞增殖存在剂量-效应关系。进一步研究,得出对Bax具有上调节作用,Bc12具有下调节作用,以及对NF-κB的抑制作用。
6.结论
EFSENN中的各个组分都有很高的抗氧化活性,Fr2中的黄酮类物质具有抗肿瘤活性,将可以用于治疗和预防多种疾病,并具有作为保健食品的潜力。