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随着我国奶牛业的快速发展,奶牛酮病发病率不断升高,对奶牛的健康和生产性能产生严重的影响。围产期的奶牛,尤其是高产奶牛,因胎儿生长和泌乳对能量的需求增加,干物质摄入量降低,致使能量摄入不能满足能量需求而出现能量负平衡,为了弥补能量赤字,机体动员体脂,过度的脂肪动员就会导致酮病的发生。反刍动物因瘤胃代谢特点几乎不能从瘤胃中直接摄取葡萄糖,机体所需的葡萄糖有90%是通过糖异生获得,而甘油作为重要的生糖物质,与糖代谢关系十分密切,可有效解决反刍动物因糖供应不足而发生的能量代谢问题。发酵法生产甘油,具有清洁安全等特点,因而受到广泛的关注。产甘油酿酒酵母NAU-ZH-GY1是拥有本实验自主知识产权,同时酿酒酵母菌也是农业部公布的允许作为饲用的益生菌,对其进行基因改造,提高甘油产量,将其发酵液制成饲料添加剂,发挥益生菌和甘油生糖的双重功效。本课题组已成功地敲除了酿酒酵母NDE1基因,以酿酒酵母代谢原理为基础,以缺失NDE1基因的酿酒酵母菌NAU-ZH-GY1-nde1△为出发菌株,超表达GPD1基因,3-磷酸甘油脱氢酶(Gpd1蛋白)的含量增加,催化磷酸二羟丙酮加氢还原3-磷酸甘油,明显提高甘油生成产量,为研发一种防控围产期奶牛能量代谢障碍性疾病的微生态制剂提供条件。试验1酵母整合载体PGC的构建扩增酿酒酵母3-磷酸甘油脱氢酶GPD1及其启动子片段,将该片段插入pUG6质粒中,pUG6质粒含有G418抗性基因和LoxP位点,然后在GPD1基因下游插入细胞色素c(CYC1)终止子片段,成功的构建了酿酒酵母整合表达载体PGC试验2产甘油酿酒酵母GPD1基因超表达突变株的构建本课题组已成功地敲除了酿酒酵母NDE1基因。在此基础上,用限制性内切酶BspT1041线性化后转化至酿酒酵母NADH脱氢酶(NDE1)敲除菌株NAU-ZH-GY1-nde1△。根据酿酒酵母同源重组机制,利用Cre/loxP重组系统GPD1增加一个拷贝,成功构建nde1完全缺失,gpd1超表达突变菌株NAU-ZH-GY1-nde1 △-gpd1。试验3酿酒酵母GPD1超表达,NDE1缺失突变株生物学特性研究本试验对试验1构建的酿酒酵母NAU-ZH-GY1-nde1△-gpd1与出发菌株NAU-ZH-GY1-nde1 △以及原始菌株NAU-ZH-GY1进行生物学性质研究,分别对菌株的生长状况、稳定性、甘油产量、生物量和发酵液中活菌数进行测定。试验结果表明两个菌株在生长状况、生物量和活菌数方面无显著差异,酿酒酵母NAU-ZH-GY1-nde1△-gpd1遗传性质稳定,甘油产量为28.04 g·L-1,比原始菌株NAU-ZH-GY1 提高了 21.12%,比出发菌株NAU-ZH-GY1-nde1△提高了 15.20%,差异显著(p<0.05)。因此,通过超表达产甘油酿酒酵母GPD1基因,完全缺失NDE1基因,甘油产量显著提高。