萜类化合物MEP生物合成途径中关键酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶的再讨论

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萜类化合物是自然界中分布最广的一类天然产物家族,目前已发现有5万多种。萜类化合物有共同的合成前体异戊烯基焦磷酸(IPP)与二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)。这两个前体的生物合成途径有两条,分别是存在于古细菌、真菌、动物(包括人类)中的甲羟戊酸(MVA)途径,以及存在于水藻、植物质体、大多数细菌(包括致病菌)中的2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径。由于MEP途径存在于致病菌中而不存在于人体内,所以MEP途径可以作为潜在靶点以筛选新的抗菌素、抗疟药、除草剂等。1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)催化MEP途径中第一步反应,是MEP途径的限速酶。目前研究己明确DXS酶具有类似转酮酶(TK)的活性,可以催化D-甘油醛-3-磷酸(D-GAP)与丙酮酸缩合反应形成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)。本课题组在研究大肠杆菌DXS (EcDXS)的转酮酶活性过程中,偶然地发现EcDXS具有类似磷酸丙糖异构酶(TPI)的活性,能够催化D-GAP与其同分异构体磷酸二羟丙酮(DHAP)发生异构化反应,从而证明DHAP也可作为EcDXS底物被催化合成DXP。这就说明EcDXS既具有类似转酮酶的活性,又具有类似磷酸丙糖异构酶的活性。我们利用柱前衍生化高效液相色谱方法动态地监测了相同反应条件下EcDXS催化底物D-GAP合成DXP与催化底物异构化为DHAP的竞争性关系,发现EcDXS的磷酸丙糖异构化活性较其转酮酶活性更强。同时,基于DXS蛋白质序列中的关键氨基酸残基改变后可能会导致DXS转酮酶活性减弱甚至消失的现象,我们尝试了利用两种定点突变技术在体外改变大肠杆菌源dxs基因中能够编码与底物D-GAP结合的关键氨基酸残基的密码子,成功构建了含有定点突变基因的重组质粒,为进一步检测关键氨基酸残基对EcDXS磷酸丙糖异构酶活性的影响提供了有效途径。
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