论文部分内容阅读
目的：明确肺炎链球菌糖酵解关键酶烯醇化酶(enolase, Eno)与热休克蛋白DnaJ是否有直接结合及结合位点,初步探讨DnaJ蛋白对Eno蛋白胞内蛋白水平及胞外分泌的影响。方法：原核表达并纯化Eno全长蛋白,鉴定其酶活性,利用重组Eno蛋白皮下免疫昆明小鼠制备特异性抗血清,分析其蛋白表达及胞外分泌情况；采用生物膜层干涉(biolayer interferometrvy, BLI)技术和直接结合实验鉴定Eno和DnaJ两者之间是否存在直接相互作用；在前者结果阳性的基础上,截短表达Eno蛋白,通过直接结合实验鉴定Eno蛋白结合DnaJ的位点。根据结合位点结果,构建一系列异位表达的重组pJWv25-eno截短片段,转化肺炎链球菌R6菌株,Western blot检测各片段的胞内及胞外蛋白水平,分析DnaJ的结合对Eno蛋白水平的影响。在肺炎链球菌中过表达DnaJ蛋白,通过Western blot检测Eno蛋白的胞内及胞外蛋白水平,进一步鉴定DnaJ对Eno蛋白胞内蛋白水平及分泌的影响。结果：成功表达重组Eno蛋白,纯度达90%,该蛋白具有a-Eno酶活性；重组Eno蛋白皮下免疫昆明小鼠后,获得效价达1：7.68×106的特异性抗血清；Western blot分析显示,7种不同血清型肺炎链球菌培养上清中均在分子量约47 kD处出现特异性反应带；直接结合试验显示,随着Eno蛋白量的增加,Eno与DnaJ的结合量也相应增加(r=0.920,P=0.000),其吸光度值从0.222±0.042(1.25μg)增加到0.569±0.099(20.0 μg)；BLI技术测定两者结合的亲和常数为926nmol/L;截短的Eno(aa1-aa100)与DnaJ的结合量2.25±0.38高于其他截短序列的结合量0.94±0.25、1.08±0.09、0.75±0.12,差异具有统计学意义(P=0.000,P=0.001,P=0.000)。Western blot结果显示,各截短片段均能在肺炎链球菌胞内表达,仅片段Eno3及Eno4可在培养上清中被检测；过表达DnaJ情况下,肺炎链球菌中胞内的Eno蛋白水平无明显变化,培养上清中的Eno蛋白量减少。结论：肺炎链球菌Eno蛋白与DnaJ蛋白存在直接结合作用,结合位点主要位于其N端的1-100个氨基酸序列。DnaJ蛋白与Eno蛋白的结合能力强弱与Eno蛋白的分泌能力无关,但DnaJ过表达可降低Eno蛋白的胞外分泌水平。