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山羊传染性胸膜肺炎(contagious caprine pleuropneumonia，CCPP)是山羊特有的急性或慢性高度接触性传染病，该疾病感染不同年龄阶段的山羊，常引起胸腔的病变，其临床特征为高热、咳嗽、呼吸困难、纤维素性胸膜肺炎、肺肝变和胸腔积液，具有很高的发病率和死亡率。本试验从重庆渝北、北碚，西藏山南等地区的病死山羊采集病料，采集部位主要为肺脏、鼻腔拭子、胸腔积液，其次为心血、肝脏、脾脏、肾脏和淋巴结等；采用改良型Hartleys培养基，普通琼脂、鲜血琼脂和LB琼脂培养基分离培养病原，从68只病死山羊分离到14株病原菌，其中4株支原体，5株山羊奇异变形杆菌，5株大肠杆菌；本试验对山羊传染性胸膜肺炎等病原进行分离鉴定、克隆测序、动物试验、药敏试验及部分生物学特性研究，为CCPP的诊断和预防提供理论基础。
1.山羊支原体的分离鉴定
为了研究CCPP病原，采用改良型Hartleys培养基，从病羊肺脏分离病原。对分离株进行糖发酵、精氨酸水解、尿素分解、四氮唑还原、膜斑形成、固醇需要等生化试验，动物试验及药敏试验；根据丝状支原体簇成员共有的16S rDNA特异性片段设计引物，进行PCR扩增。分离到4株病原，编号分别为BB3、BB7、BB42、YB2；生化试验结果表明分离株BB7、BB42生化特性与标准株PG3相同，分离株BB3、YB2生化特性与PG3存在差异；BB7、YB2对小鼠有致病性，BB3、BB42对小鼠无致病性；分离株对头孢噻呋钠的MIC值最低，说明分离株对头孢噻呋钠最敏感，其次为泰乐菌素、红霉素、氟苯尼考等，而对林可霉素不敏感；分离株和标准株均扩增出548 bp片段。结果表明分离株属于丝状支原体簇。
2.山羊奇异变形杆菌的分离鉴定及克隆测序
为了分离鉴定病原，采用普通琼脂、鲜血琼脂和LB琼脂培养基，从病死山羊肺脏等分离病原菌，对分离株进行游散行为分析、生化鉴定、动物试验和药敏试验；根据细菌16S rDNA序列设计引物，对分离株进行PCR扩增和克隆测序。分离到5株病原菌；分离株培养2.5 h-3.5 h开始迁徙，迁徙距离主要随培养时间的延长而增加，迁徙速度2.5 h-4.5 h呈增长趋势，5 h-5.5 h呈下降趋势；在相同的培养时间下，分离株在0.5％琼脂的培养基上迁徙距离最远，其次为1.0％、1.5％、2.0％琼脂，说明迁徙距离与琼脂浓度呈负相关关系；分离株具有奇异变形杆菌的基本生化特性；分离株均对小鼠有致病性，LD50为2.5000×107 cfu·mL-1～4.4453×107cfu·mL-1；分离株对丁胺卡那霉素、头孢他啶敏感，对环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、卡那霉素、庆大霉素、氟苯尼考等药物不敏感；分离株扩增出1535 bp条带，与奇异变形杆菌的同源率为99.5％～99.8％。分离株鉴定为奇异变形杆菌。
3.山羊奇异变形杆菌毒力因子zapA基因的克隆及蛋白结构预测
为了研究山羊奇异变形杆菌的毒力因子，克隆zapA基因和预测推导的蛋白结构。采用PCR方法，对山羊奇异变形杆菌毒力因子zapA基因进行扩增、克隆及序列测定；利用生物信息学软件预测ZapA蛋白的信号肽、跨膜区、二级结构及B细胞抗原表位。结果表明，zapA基因长为1476 bp，编码491个氨基酸，与参考株的核苷酸序列同源性为99.59％，氨基酸同源性为99.59％；ZapA蛋白存在信号肽，无跨膜区；B细胞表位可能位于69-71，78-84，136-139，197-199，353-356，371-373，472-474氨基酸区域内或附近。山羊奇异变形杆菌存在毒力因子zapA基因，ZapA蛋白结构的预测为蛋白的表达及基因工程疫苗的研制提供理论基础。
4.山羊奇异变形杆菌PCR-RFLP分析
为了研究山羊奇异变形杆菌的多态性，对分离株16S rDNA和zapA基因进行RFLP分析。采用PCR方法，分别扩增分离株的16S rDNA和zapA基因，胶回收PCR扩增产物；选用限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ对16S rDNA基因进行RFLP分析，选用内切酶Bal1、DraⅠ、VspⅠ对zapA基因进行RFLP分析；EcoRⅠ酶切产生868 bp、667 bp片段，HindⅢ酶切产生1462 bp、73 bp片段，BalⅠ酶切产生633bp、474 bp、369 bp片段，DraⅠ酶切产生796 bp、627 bp、49 bp、4 bp片段，VspⅠ酶切产生864 bp、411 bp、115 bp、86 bp片段，均与电子酶切结果相符。结果表明分离株16S rDNA和zapA基因均未产生限制性片段长度多态性，酶切位点未发生改变，说明16S rDNA和zapA基因在一定程度上具有很高的保守性。
5.山羊大肠杆菌的分离鉴定及克隆测序
为了分离鉴定病原，采用普通琼脂和鲜血琼脂培养基，从病死山羊肺脏等分离病原，对分离株进行生化鉴定、动物试验和药敏试验；根据细菌16S rDNA序列设计引物，对分离株进行PCR扩增和克隆测序。分离到5株病原菌，分离株具有大肠杆菌的生化特性；分离株均对小鼠有致病性，LD50为4.8395×107cfu·mL-1～1.0375×108 cfu·mL-1；分离菌株对壮观霉素、痢特灵敏感，对头孢曲松钠、先锋必素、先锋霉素Ⅴ、氨苄西林、羧苄西林、阿莫西林、强力霉素、氟苯尼考等不敏感；分离株与大肠杆菌的同源性为98.50％-99.79％；分离株鉴定为大肠杆菌。