研究目的：我国高原山地面积分布广泛，3000米以上的高海拔地区占陆地面积的1/6，且大多处于我国边境地区，战略意义十分重要。低氧、低温是影响高原地区人体健康和作业能力的主要环境因素。血管内皮细胞是机体低氧、低温暴露过程中最易受损伤的部位；内皮细胞的功能紊乱能够直接影响高原特发性疾病的发生发展；逆转内皮细胞的功能紊乱可成为防治高原环境因素损伤疾病的重要策略。因此，研究高原低氧、低温及复合条件对内皮细胞的影响及其机制，探讨内皮细胞保护药物具有重要的实用价值。本研究通过建立模拟高原低氧低温复合损伤的整体动物模型和内皮细胞损伤的体外模型，探讨高原低氧低温复合作用对血管内皮细胞的损伤规律和作用机制；进而在此基础上，研究ATP敏感性钾通道开放剂二氮嗪防治低氧低温所致血管内皮细胞损伤的作用。本研究将为进一步认识高原环境因素损伤和研发新的高原特发疾病防治药物提供理论依据。研究方法：1.模拟高原低氧、低温及其复合环境因素对血管内皮细胞及儿茶酚胺类内分泌激素影响的整体动物实验。采用高原减压低氧和低温复合实验舱模拟高原环境；南京建成NO测定试剂盒检测NO；上海蓝基ELISA试剂盒检测ADR、NADR、ET的表达；武汉博士德ELISA试剂盒检测VEGF的表达。（1）高原低氧低温复合作用对大鼠血管内皮功能和儿茶酚胺类内分泌激素的影响。分别设置正常对照组（2m、25℃）、低氧低温复合1组（3000m、10℃）、低氧低温复合2组（6000m、10℃）、低氧低温复合3组（6000m、10℃）、低氧低温复合4组（6000m、-5℃）。在低氧低温复合环境下干预1小时。测定实验动物血清中NO、ADR含量的变化，采用单因素方差分析、多因素方差分析、析因方差分析，以确定低氧低温复合环境下是否能够对实验动物造成血管内皮功能和ADR含量的变化，并且确定高原低氧低温复合损伤的海拔和温度。（2）高原低氧、低温及其复合作用对大鼠血管内皮功能和儿茶酚胺类内分泌激素的影响。分别设置正常对照组（2m、25℃）、高原低氧组（6000m、25℃）、高原低温组（2m、-5℃）、高原低氧低温复合组（6000m、-5℃），干预1小时。测定实验动物血清中NO、VEGF、ADR、NADR含量的变化，采用独立样本T检验、单因素方差分析、多因素方差分析、析因方差分析，以确定低氧、低温以及低氧低温复合环境的对实验动物血管内皮功能和儿茶酚胺类内分泌激素的影响。此外，分别设置对照组、高原低氧低温复合组1h组（6000m、-5℃、1h）、高原低氧低温复合组4h组（6000m、-5℃、4h）和高原低氧低温复合组8h组（6000m、-5℃、8h）。测定实验动物血清中NO、ET、VEGF、ADR、NADR含量的变化，采用单因素方差分析以明确低氧低温的作用时间对血管内皮和儿茶酚胺类内分泌激素的影响，并综合以上结果，进行分析确定急性高原低氧低温暴露复合损伤的动物模型。2.模拟高原低氧、低温及其复合环境因素对血管内皮细胞影响的体外细胞实验。采用主动脉血管片贴壁培养法，体外培养雄性Wistar大鼠主动脉血管内皮细胞；ADR模拟低温环境对内皮细胞的影响；南京建成LDH、NO、NOS测定试剂盒检测细胞培养液中LDH、NO以及NOS的含量；MTT法检测内皮细胞存活率；流式细胞仪检测内皮细胞的凋亡；上海蓝基ELISA试剂盒检测VEGF、ET、HIF1-a的表达。（1）模拟高原低氧环境对血管内皮细胞的影响。分别设置正常对照组（21%O2，37℃）、低氧24h组（1%O2，37℃，24h）、低氧25h组（1%O2，37℃，25h）、低氧27h组（1%O2，37℃，27h）。（2）肾上腺素（ADR）模拟低温环境以及复合低氧环境对内皮细胞的影响时，分别设置正常对照组、ADR1组（ADR终浓度为0.1mmol/L）、ADR2组（ADR终浓度为0.01mmol/L）、ADR3组（ADR终浓度为0.001mmol/L）。（3）模拟高原低氧低温复合环境因素对内皮细胞的影响。分别设置正常对照组、低氧组（1%O2、92%N2、5%CO2、37℃、27h）、ADR组（ADR终浓度为0.1mmol/L常氧环境培养）、低氧ADR组（ADR终浓度为0.1mmol/L、1%O2、92%N2、5%CO2、37℃、27h）。采用独立样本T检验、单因素方差分析，阐明低氧低温复合损伤与单一因素的损伤特点，明确低氧低温复合作用内皮细胞损伤作用规律，并探讨其相关机制。3.二氮嗪对模拟高原低氧、低温及其复合环境因素血管内皮细胞损伤的防治作用。（1）二氮嗪对低氧致内皮细胞损伤的防治作用。分别设置正常对照组、低氧+二氮嗪组（二氮嗪终浓度为0.1mmol/L的无血清M199培养基与内皮细胞置于低氧培养箱中低氧暴露27h）、低氧+二氮嗪+5-HD组（二氮嗪和5-HD终浓度为0.1mmol/L的无血清M199培养基与内皮细胞置于低氧培养箱中低氧暴露27h）。（2）二氮嗪对低氧低温复合因素致内皮细胞损伤的防治作用。分别设置正常对照组、低氧ADR+二氮嗪组（ADR和二氮嗪终浓度为0.1mmol/L的无血清M199培养基与内皮细胞置于低氧培养箱中低氧暴露27h）、低氧+ADR+二氮嗪+5-HD组（ADR、二氮嗪、5-HD终浓度为0.1mmol/L的无血清M199培养基与内皮细胞置于低氧培养箱中低氧暴露27h）。采用独立样本T检验、单因素方差分析，探明二氮嗪对低氧及低氧低温复合因素致内皮细胞损伤的保护作用。研究结果：1.高原低氧低温复合作用对大鼠血管内皮功能和儿茶酚胺类内分泌激素的影响。（1）分别在海拔3000m、6000m时观察不同温度（10℃、-5℃）对大鼠血清NO、ADR影响。与对照组相比，海拔3000m、10℃环境暴露下，血清NO呈现下降趋势，无统计学上显著性差异；海拔3000m、-5℃环境可引起血清NO含量的显著下降（P<0.05）。与对照组相比，海拔3000m、10℃和3000m、-5℃环境暴露下大鼠血清ADR含量显著升高（P<0.01）。在海拔6000m、10℃的环境下大鼠血清NO、ADR含量没有显著变化。与对照组相比，海拔6000m、-5℃环境下大鼠血清NO的释放量显著降低（P<0.01），ADR的释放量显著升高（P<0.01）。多因素方差分析结果显示，海拔高度和温度的交互作用对ADR的产生了显著的影响（P<0.05）。（2）高原低氧、低温以及其复合作用对大鼠血管内皮功能和儿茶酚胺类内分泌激素的影响。分别观察海拔6000m和低温-5℃及其复合作用对大鼠血清NO、VEGF、ADR、NADR影响。与对照组相比，高海拔低氧组（6000m、25℃、1h）大鼠血清NO的含量显著降低（P<0.05），VEGF的释放量显著升高（P<0.05），ADR、NADR的释放量有所升高，无统计学上显著性差异。与对照组相比，低温组（0m、-5℃、1h）大鼠NO的释放量有所降低，无统计学上显著性差异；VEGF的释放量显著升高（P<0.01），ADR、NADR的释放量显著升高（P<0.01）。与对照组相比，低氧低温（6000m、-5℃、1h）复合环境下NO的含量显著下降（P<0.01）；VEGF、ADR、NADR表达显著增高（P<0.01）。海拔高度对NO、VEGF、ADR都具有显著影响（P<0.05），温度对ADR、NADR具有显著影响（P<0.05），海拔高度和温度的交互作用对NO、NADR没有显著影响（P<0.05），但是对VEGF、ADR的产生了显著的影响（P<0.05）。（3）高原低氧、低温以及其复合作用对血管内皮细胞功能和儿茶酚胺类内分泌激素影响的时间特点的结果显示，与对照组相比，低氧低温复合干预1h、4h组，大鼠NO的释放量显著降低（P<0.01）。VEGF的含量在1h组（P<0.01）、4h组（P<0.05）显著升高，8h组无统计学上显著性差异。4h组ET的含量显著升高（P<0.05），1h组和8h组无统计学上显著性差异。1h、4h组ADR、NADR的释放显著升高（P<0.01）。2.体外模拟低氧低温环境对血管内皮细胞的损伤作用（1）采用主动脉血管片贴壁的方法，培养出大鼠主动脉内皮细胞，经CD31免疫荧光鉴定，内皮细胞阳性率96%以上。（2）1%O2的低氧环境下27h可促使血管内皮细胞LDH含量增加（P<0.01），细胞存活率、NO、NOS含量显著下降（P<0.01），VEGF、ET、HIF1a表达增高（P<0.01），细胞凋亡增加。（3）ADR浓度为0.1mmol/L可促使血管内皮细胞LDH含量增加（P<0.01），细胞存活率显著下降（P<0.01），VEGF、ET、HIF1a表达增高（P<0.01），细胞凋亡增加。（4）ADR浓度为0.1mmol/L干预的内皮细胞在低氧（1%O2）环境中培养27h，发现LDH含量增加（P<0.01），细胞存活率下降（P<0.01），NO含量下降（P<0.01），NOS含量呈现下降趋势，VEGF、ET、HIF1a表达增高（P<0.01），细胞凋亡增加（P<0.01）。3.二氮嗪对低氧以及低氧低温复合作用致血管内皮细胞损伤的防治作用（1）终浓度为0.1mmol/L的二氮嗪干预的内皮细胞在1%O2的低氧环境中培养27h，与对照组相比无统计学上显著性差异；与低氧组相比LDH含量显著下降（P<0.01），细胞存活率显著增高（P<0.01），NO、NOS释放量显著上升（P<0.01），VEGF、ET的表达下降（P<0.01），并且细胞凋亡也显著降低（P<0.01）。（2）终浓度为0.1mmol/L的二氮嗪和ADR干预的内皮细胞在1%O2的低氧环境中培养27h，与低氧组相比LDH含量显著下降（P<0.01），细胞存活率显著增高（P<0.01），VEGF、ET的表达下降（P<0.01），并且细胞凋亡也显著降低（P<0.01）；NO、NOS的释放量显著降低（P<0.01），HIF1a表达增高（P<0.01）。结论：1.模拟高原低氧低温复合环境因素急性暴露可导致儿茶酚胺类内分泌激素的含量增加，大鼠血管内皮功能损伤。（1）海拔6000米-5℃的模拟高原低氧低温复合环境能导致实验动物大鼠血清儿茶酚胺类内分泌激素的升高，血管内皮功能的降低；与以上复合环境相比，6000米10℃的复合环境对血管内皮功能和儿茶酚胺类内分泌激素作用减轻。结果提示，低氧低温复合环境下儿茶酚胺类内分泌激素的升高可能是导致血管内皮损伤的重要影响因素，与低氧交互作用能够促使并加剧血管内皮的严重损伤。（2）多因素方差分析和析因方差分析结果表明，在海拔较低（3000m）、温度较高（10℃）的环境下，海拔高度和温度以及复合作用对内皮细胞的损伤并不显著，但是随着海拔的升高（6000m）和温度的降低（-5℃），海拔高度和温度的复合作用能够发生叠加效应造成内皮细胞的严重损伤。6000米-5℃的低氧低温复合环境能够显著影响实验动物内皮功能和儿茶酚胺类内分泌激素的变化，干预4小时能够造成大鼠血管内皮细胞的急性低氧低温复合损伤。2.模拟高原低氧暴露能够对血管内皮细胞造成损伤；ADR模拟低温暴露能够对血管内皮细胞造成损伤；二者复合作用能够导致血管内皮细胞损伤。3. ATP敏感性钾通道开放剂二氮嗪能够改善低氧处理所造成的血管内皮细胞损伤；也可改善低氧复合ADR所造成的血管内皮细胞损伤。综上所述，本研究结果表明，高原的低氧低温复合作用对血管内皮细胞的损伤作用具有特殊的规律，二者的复合作用在随着海拔高度的升高、温度的下降可呈现叠加效应；ATP敏感性钾通道开放剂二氮嗪具有防治低氧低温复合环境因素所致血管内皮细胞损伤的作用。