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多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFA)是细胞质膜和细胞器膜的重要组分,通过调节基因的表达影响细胞的脂肪酸代谢和生命健康活动。N-3 PUFA通过提高肌纤维蛋白合成、增强肌细胞收缩功能、抑制肌肉萎缩,有效改善肌肉的代谢活动。肌纤维收缩需要消耗能量,但n-3 PUFA参与调节肌肉能量代谢作用机理还不清楚。为此,本研究利用转基因小鼠模型,系统分析n-3 PUFA调节肌纤维代谢可能机制。首先从胡麻中克隆了脂肪酸去饱和酶基因Fad3b,并获得了Fad3b转基因小鼠。Fad3b转基因小鼠各器官组织中PUFA含量均发生变化,其中,肌肉组织n-3 PUFA显著上升,尤其是DHA含量显著增多至对照小鼠的2.66倍。Fad3b诱使肌肉组织中DHA含量增加可能是影响肌肉组织PUFA组成变化的关键。对Fad3b转基因小鼠和对照小鼠肌肉组织进行转录物组和蛋白质组分析,共获得转录组差异基因1654个,其中在Fad3b实验组表达上调的基因909个,下调的基因745个;差异蛋白407个,其中Fad3b组中表达上调的蛋白203个,下调的204个。通过转录组和蛋白质组的联合分析可以看出,小鼠肌肉中过表达的Fad3b基因改变了细胞线粒体相关的能量代谢过程,促进了脂肪酸代谢,但是抑制了线粒体氧化磷酸化和糖代谢。为进一步研究肌肉中n-3PUFA水平改变对于肌肉能量代谢的影响,我们培养了Fad3b转基因小鼠的肌肉卫星细胞(F-MSCs)。基于该细胞模型,进一步分析线粒体的形态、分布以及脂肪酸、糖、三羧酸循环以及氧化磷酸化的变化。与WT-MSCs相比,F-MSCs中线粒体较细、短,零散的分布在核周围。将F-MSCs、WT-MSCs以及100ng/ml的DHA处理的WT-MSCs(DT-MSCs)向脂肪分化,F-MSCs、DT-MSCs分化后形成的脂滴数量和体积明显少于WT-MSCs,甘油三酯水解酶的活性显著增强,甘油的生成速率显著加快,表明n-3 PUFA可以促进脂肪分化过程中脂滴的分解,进而抑制甘油三酯在脂肪细胞中的积累。同时,我们还检测了脂肪酸β氧化过程中的关键基因,发现促进脂肪酸氧化的信号调控通路相关的基因AMPK、PGC1α、PPARα、ACAA1等在F-MSCs和DT-MSCs中均显著上调,说明n-3PUFA提高了肌肉细胞中脂肪酸β氧化水平和速率。在葡萄糖代谢检测时发现:F-MSCs和DT-MSCs中葡萄糖含量及葡萄糖转运体Glut4的表达量显著高于WT-MSCs,参与糖酵解的己糖激酶表达量显著高于WT-MSCs(P<0.05),但是磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的表达量显著低于WT-MSCs(P<0.05),细胞中丙酮酸含量也显著降低(P<0.05),糖酵解过程受到了显著抑制;在F-MSCs和DT-MSCs中糖原含量显著增加(P<0.05)。调控细胞糖代谢的Akt2表达量显著降低(P<0.05),Akt2通过抑制磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的活性抑制了糖酵解过程,同时又通过抑制GSK3,激活了糖原合成途径。在线粒体三羧酸循环和氧化磷酸化检测时发现,F-MSCs和DT-MSCs中的乙酰辅酶A水平显著增加,柠檬酸合酶的活性及产物柠檬酸水平显著上调;但是柠檬酸生成异柠檬的限速酶,即异柠檬酸脱氢酶的表达和活性显著下降;TCA中关键限速酶α-酮戊二酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶复合体A、苹果酸脱氢酶2的表达均显著下调。上述结果表明,n-3 PUFA通过降低限速酶的活性抑制了三羧酸循环,致使NAD+在细胞中异常积累,NADH的浓度显著减少。进一步检测线粒体内膜的电子呼吸链活性,发现,呼吸链复合体I、复合体IV和ATP酶活性显著降低,编码复合体关键亚基的基因Ndufb5和Atp5a/h/b表达量也显著下调,线粒体膜电位显著降低,ATP的合成减少。综上所述,肌组织和细胞中n-3PUFA水平的增加,促进了细胞内脂肪酸的氧化代谢和糖原合成,但是抑制了葡萄糖的有氧氧化和磷酸戊糖循环,线粒体内三羧酸循环和呼吸链复合体活性也显著降低,进而抑制了氧化磷酸化生成ATP。