研究背景世界上超过3.5亿人为慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染,在中国慢性感染人数占总人口的7.18%,约9300万人,这导致肝硬化、肝功能失代偿、肝细胞癌(HCC)的患病风险大大增加,严重危害人们身心健康。HBV的传播以经血传播为主,如母婴传播和有创暴露。急性感染HBV的慢性化风险新生儿感染达90%,婴儿感染约25%-30%,成人感染低于5%。目前慢性HBV感染多由于母婴传播或婴幼儿期HBV感染,其自然史根据病毒与宿主之间的相互作用可分为：免疫耐受期(immune tolerance phase,IT),免疫清除期(immune clearance phase),非活动期(inactive carrier state phase,IC)和再活动期(Reactivation phase)。多数IT患者呈HBeAg阳性、高水平HBV DNA、正常稳定的ALT和肝组织学无明显病变；相当的IT患者会进入免疫清除期,表现为ALT逐渐升高,HBV DNA稍下降,HBeAg持续阳性,肝组织出现病理损伤,此为常见的HBeAg阳性慢性乙型肝炎(CHB)病人；其中的HBeAg清除率每年为8%-12%,自发实现]HBeAg血清学转换的患者中67%到80%HBV DNA检测不到或呈低水平,ALT正常稳定,肝组织病理未见进展,此为IC患者,处于一种对HBV的免疫控制状态；另外,多是病毒突变发生免疫逃逸所致,10%到20%的IC出现HBV再激活和肝组织的病变进展,即为活动期,多表现为HBeAg阴性乙型肝炎。临床上CHB患者抗病毒治疗的目的是抑制病毒复制,减轻肝脏病理损伤,相对满意的疗效是实现HBeAg血清学转换。无论是自发的还是药物诱导的HBeAg血清学转换,均意味着达到一种相对稳定的免疫控制状态,能减少肝脏并发症和提高生存率,IC患者即可认为是自发HBeAg血清学转换后的状态。但是无论自发的还是抗病毒治疗诱导的HBeAg血清学转换率仍低,很多即使经抗病治疗抑制HBV至相当低水平时仍未能出现HBeAg血清学转换,其中的机制仍不明。有研究显示其与某些免疫学因素相关,如IL-10和IL-12的血清水平及相应的基因多态性与早期自发的HBeAg血清学转换相关,IL-12与IL-21水平的变化和差异与治疗诱导的HBeAg血清学转换相关,但其中确切的免疫学机制还是不清楚。不能达到免疫控制状态更多被认为与对HBV免疫应答低下的相关,从急性自限性乙型肝炎中可以得到启示,对HBV实现免疫清除和控制与强劲的、广谱的HBV特异性T细胞相关,相反,在CHB中T细胞对HBV的免疫应答微弱、寡克隆和难以测及；有研究显示IC患者无论在外周血和肝脏中比CHB均有更多功能性HBV特异性的CD8+T细胞,在IC或IFN-a治疗诱导实现HBeAg血清学转换的患者当中其CD8+T细胞应答程度上和特异性与自限性乙型肝炎恢复期的患者中相近,提示CD8+T细胞免疫应答低下与未能实现对HBV的免疫控制密切相关。HBV特异性CD8+T细胞的功能低下与多种因素相关,如CHB中功能缺损的树突状细胞(dendritic cells,DC)、高水平的CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)、 PD-1高表达的耗竭性HBV特异性T细胞等,但这些仍未见与HBeAg血清学转换密切相关或能早期预测HBeAg血清学转换的报道,可能还不是其中的关键因素,或者还存在其他因素。免疫学当中越来越多研究显示免疫负调节特别是负调节性T细胞在维持对自身和外源抗原的免疫耐受或免疫低应答当中起重要作用,本研究中我们关注了另一具有免疫负调节作用的T细胞亚群,CD4-CD8-双阴性T细胞(CD4-CD8-double-negative T cell, DNT), DNT细胞根据T细胞受体(TCR)的αβ链和γδ链分为αβDNT细胞和γδDNT细胞。αβDNT细胞在小鼠和人中均是分化成熟、具备自身表型特点的T细胞亚群,能特异性抑制CD8+T细胞的功能,近期在HBeAg-TCR双转基因小鼠的研究当中显示,HBeAg特异性的αβDNT细胞能显著抑制HBeAg特异性的和非特异性的效应性T细胞,人异体血干细胞移植治疗后αβDNT外周血频数高的患者移植物抗宿主病发病率低,提示αβDNT细胞参与了外周免疫耐受。γδDNT细胞属于γδT细胞,γδT细胞大部分不表达CD4或CD8,小鼠和人γδT的研究中均显示γδT细胞在保护性免疫中有重要作用,也有越来越多的研究显示小鼠γδT对免疫耐受是不可或缺,特别是口服耐受、眼器官耐受以及对肿瘤的低应答性均与其密切相关,人γδT细胞也陆续有报道发现具备重要的免疫调节作用。于是我们推测,αβDNT细胞和γδDNT在HBV慢性感染过程中有可能参与了对HBV的免疫应答低下。本研究首先选择处于HBV不同自然史分期的人群,包括IT、CHB、IC漫性HBV感染者及健康人对照(HC),检测循环中DNT细胞亚群的频数,横向分析其与对HBV不同免疫状态的关系；接着在替比夫定(LDT)治疗52W周的临床队列中纵向分析DNT细胞亚群频数的变化以及与HBeAg血清学转换的关系；根据横向研究和纵向研究结果,体外实验探讨DNT细胞对CD8+T细胞功能的影响,并且通过检测DNT表达的活化分子、免疫共抑制分子的和潜在分泌的细胞因子来进一步探讨DNT在CHB中的免疫学特点。研究目的探讨αβ3DNT细胞和γδDNT细胞与慢性HBV感染和抗病毒治疗的关系以及在其中所起的作用。研究方法1.研究对象：横向研究中选取了3组慢性HBV感染患者,所有的患者来源于南方医院门诊病人,根据2009年AASLD的自然史分期标准进行分组,HBsAg阳性均大于6个月,年龄18-60岁,其中有IT组有22例,ALT至少两次正常(ALT≤0IU/L),高水平HBV DNA (>1×107copies/mL);IC组有25例患者,符合HBeAg-阴性,anti-HBe-阳性,ALT≤40IU/L和HBV DNA<1×104copies/mL; CHB组患者有68例,其中51例来自于临床试验中的基线标本,患者要求至少两次ALT>40IU/L, HBV DNA>1×105copies/mL和HBeAg-|阳性。健康对照组有32例,招募于南方医科大学教职员工和学生,均为HBeAg-阴性、anti-HBe-阴性和ALT≤40IU/L,排除肝脏病史。纵向研究对象为LDT单药治疗的病人,来自南方医院感染内科两个临床试验：一项多中心开放的替比夫定治疗iv期临床试验("phase IV, multi-center, open-label clinical trial of telbivudine", n=21, LDT600mg/d, trial CLDT600ACN07T)和一项关于替比夫定优化治疗的临床试验"the Efficacy Optimization Research of Telbivudine Therapy trial", EFFORT, n=30, trial NCT00962533)。患者主要的入选标准同CHB,所有患者要求抗丙肝病毒、抗丁肝病毒、抗甲肝病毒IgM、抗戊肝病毒IgM和抗艾滋病病毒抗体都为阴性,在LDT治疗过程中分别留取了基线、12周、24周和52周血标本,用于检测DNT细胞亚群。2.外周血单个核淋巴细胞的分离(PBMC)和流式检测：PBMC采用Ficoll-Hypaque梯度离心法进行分离,并用含10%二甲亚砜的胎牛血清中梯度冻存至液氮,用时经复苏后用荧光素偶联抗体进行标记检测DNT细胞亚群：anti-CD3-APC (UCTH1)、anti-TCRγδ-FITC(11F2)、anti-CD4-PE、anti-CD8-PE和anti-TCRαβ-PE-Cy7(IP26)。3.肝脏侵浸润淋巴细胞(Liver-infliltrating lymphocytes, LIL)的分离：肝穿组织在满足常规肝活检组织病理分析诊断的情况下有多余时用于LIL的分离。用眼科剪柔和地将肝组织剪成1-2mm3细块,用10%FBS-RPMI1640(R10)洗涤两次,洗去残余的血块之后放入消化液(含500μg/mL胶原酶Ⅳ、20μg/mL DNaseⅠ、2%FBS和0.6%BSA中37℃消化30min,总消化液通过70-nm尼龙滤膜过滤去除残余的组织块,滤液500g/min离心7min,0.5%PBS洗涤一次后,与同期获取的PBMC进行流式标记检测DNT亚群。4.胞内细胞因子的染色(intracellular cytokine staining, ICS):由Sigma-Aldrich公司合成的26段18肽(Core peptides pool)以重叠10个氨基酸残基覆盖HBV核心蛋白开放阅读框序列全长,标记为Core,以HIV gag蛋白上的一18肽作为阴性对照。按下操作进行ICS检测：以5×105个细胞/100gL的细胞浓度培养,加入刺激物(分为“空白刺激”、"anti-CD3(OKT,5μg/mL)和anti-CD28(1μg/mL) antibodies"、"peptides (3μg/mL)、anti-CD49d(1μg/mL)和anti-CD28(1μg/mL)"或者"50ng/mL Phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA)和1μmol/L calcium ionomycin")1h后,再加入BrefeldinA(1μg/mL)继续培养5h。收集细胞用流式检测抗体进行表型标记(如CD3、CD4、CD8等),依次细胞洗涤、固定和破膜后用检测细胞因子的荧光素抗体进行标记,上流式细胞仪检测和分析。5. γδDNT细胞对CD8+T细胞功能的影响：5.1γδDNT细胞对HBV特异性CD8+T细胞应答的影响：γδT细胞频数中不到1%的细胞表达CD4暂可忽略,纯化γδDNT时主要是去除CD8+γδT细胞,先用anti-CD8磁珠去除PBMC中的CD8+细胞获取CD8(-)PBMC,再用γδT细胞磁珠分选试剂盒阳性分选出γδT细胞,记为γδDNT细胞,检测其纯度。γδDNT细胞与TCRγδ(-)PBMC以1：2混合,与TCRγδ(-)PBMC管分别加入Core(终浓度3μg/mL)刺激培养,同时TCRγδ(-)PBMC管设置加或不加HIV短肽(Gag)作为阴性对照或空白对照,每管细胞数6×105,采用ICS(细胞表型采用anti-TCRγδ-FITC、anti-TCRαβ-PE-Cy7和anti-CD8-APC-Cy7标记)检测αβCD8+T细胞中IFN-γ(PerCP-Cy5)的产生。5.2不同γδT细胞频数对HBV特异性CD8+T细胞应答的影响：选择γδDNT/γδT>80%的患者,分离γδT细胞与TCRγδ(-)PBMC,γδT细胞与TCRγδ(-)PBMC以0：8、1：2、1：4和1：2混合,在Core刺激下,采用ICS(细胞表型采用anti-TCγδ8-FITC、anti-TCRαβ-PE-Cy7和anti-CD8-APC-Cy7标记)检测各比例组在αβCD8+T细胞中IFN-γ(PerCP-Cy5)和TNF-α(PE)的产生。5.3不同γδT细胞频数对CD8+细胞非特性活化产生IFN-γ的影响：γδT细胞(γδDNT/γδT>80%)与TCRγδ(-)PBMC以0：16、1：16、1：4、1：2和1：1混合,分别在5μg/mL anti-CD3(OKT3)和1μg/mL anti-CD28抗体刺激下,采用ICS方法(细胞表型采用anti-TCRgd-FITC、anti-CD8-APC-Cy7和anti-CD4-APC抗体标记),胞内采用IFN-γ-PerCP-Cy5标记检测IFN-γ在CD8+细胞中的产生。5.4不同γδT细胞频数对CD8+细胞非特性增殖的影响：γδT细胞(γδNT/γδT>80%)与CFSE标记的TCRγδ(-)PBMC以0:16、1:16、1:4、1:2和1：1混合,每管细胞数5×105,5μg/mL anti-CD3(OKT3)和1μg/mL anti-CD28抗体刺激下,培养3天(严格不超过3天),用anti-CD8-PE和anti-CD4-APC抗体标记,检测CD8+细胞的增殖百分比。6.CHB中DNT细胞亚群的免疫学特点：来源于横向研究的病人标本同时应用于对DNT的免疫学特点分析,采用以下荧光抗体组合进行流式检测分析：6.1.活化分子的表达：CD69和HLA-DR:anti-CD3-APC-Cy7、anti-CD4-APC、anti-CD8-APC anti-TCRγδ-FITC、anti-CD69-PE-Cy7和anti-HLA-DR-PE6.2.共抑制分子的表达：6.2.1.PD-1和PD-L1:anti-CD3-APC-Cy7、anti-CD4-APC、 anti-CD8-APC、anti-TCRy8-FITC、anti-PD-1-PE-Cy7和anti-PD-L1-PE6.2.2.CD160和BTLA4:1anti-CD3-APC-Cy7、anti-CD4-FITC、anti-CD8-FITC、anti-TCRap-PE-Cy7、anti-BTLA-PE和anti-CD160-Alex fluor6476.2.3. NKG2A:anti-CD3-APC-Cy7、anti-TCRγδ-FITC、anti-CD4-PE-Cy7、 anti-CD8-PerCP、anti-CD56-APC和anti-NKG2A-PE6.3.潜在的细胞因子分泌功能：6.3.1从CHB患者中留取的新鲜全血直接加入brefeldinA(1μg/mL)培养6h,采用ICS方法检测DNT细胞亚群中TGF-β和IFN-γ细胞因子的产生：anti-CD3-APC-Cy7、anti-CD4-APC、anti-CD8-APC、anti-TCRγδ-FITC、anti-TGF-β-PerCp Cy5.5和anti-IFN-γ-PE。6.3.2从CHB患者中的新鲜分离的PBMC采用PMA刺激方法进行检测TGF-β、IFN-γ、IL-10、IL-17和IL21等细胞因子的产生。7.HBV抗原对DNT细胞亚群频数的影响：从LDT治疗超过52周的患者中包括15例非应答者和11例应答者中分离的新鲜PBMC,经CFSE标记后分为3组不同刺激物培养：空白孔、rHBcAg(10μg/mL)和rHBeAg(10μg/mL),7d后收集细胞进行荧光抗体标记：anti-CD3-APC-Cy7、anti-CD4-APC、 anti-CD8-APC和anti-TCRαβ-PE-Cy7,流式分析增殖细胞中DNT细胞亚群的频数。8.统计学分析：HBV DNA转换为log值进行统计学分析,数据以中位数(范围)表示,根据不同数据采取合适的统计学分析方法,,包括Chi-Square Tests、 Kruskal-Wallis H test、Mann-Whitney U test、Friedman Test、Wilcoxon matched pairs test、Spearman rank order correlation coefficient、logistic regression和receiver-operating characteristic curves(ROC),所用统计学软件包括SPSS13.0和GraphPad Prism5,统计学水准：P值(双侧)<0.05被认为有统计学意义。结果1.在HBeAg阳性和阴性HBV慢性感染者中横向比较DNT细胞亚群频数。外周血αβDNT细胞、γδDNT细胞、和总γδT细胞在CD3+细胞中的频数依次在IT、CHB、IC和HC组中进行统计学比较,在总体比较(Kruskal-Wallis H test)有统计学差别的前提下比较两组之间的差异(Mann-Whitney U test), αβDNT细胞(overall P=0.006)在CHB组(1.02%)显著高于HC组(0.72%,P=0.007)和IC组(0.70%,P=0.006),在IT组(0.97%)与HC(P=0.073)或与IC组(P=0.052)之间尚无统计学差别；而γδDNT细胞在CHB组(8.3%)显著高于HC组(5.4%,P=0.002)和IC组(5.5%,P=0.004),并且在IT组(6.8%)也高于HC组(P=0.027)和IC组(P=0.030)；γδT细胞除了在IT组中与HC组没有显著差异(P=0.103),在各组间的统计学比较结果与γδDNT细胞类似。另外我们还分析了CD4+/CD8+γδT细胞的情况,CD4+/CD8+γδT%=γδT%-γδDNT%,在各组总体间没有统计学差异(P=0.305),各细胞亚群在CHB组与IT组之间或IC组与HC组之间均没有显著差异。Spearman相关分析显示4种细胞亚群的频数与HBV-DNA,ALT, AST或age之间均没有显著相关。2.抗病毒治疗过程中γδDNT细胞与HBeAg血清学转换有关LDT抗病毒治疗过程中,总体比较αβDNT细胞并没有显著变化(overall by Friedman test, P=0.125),但其他时间点与基线比较时,αβDNT细胞在24W(Wilcoxon matched pairs test, P=0.009)或52W(P=0.010)有所下降,γδDNT细胞,CD4+/CD8+γδT细胞和总的γδT细胞频数在各时间点之间均没有统计学差异(P>0.05)。52周后分为HBeAg血清学转换(应答组)和非血清学转换(非应答组)之间的差异,各时间点αβDNT细胞和CD4+/CD8+γδT细胞频数在应答组和非应答组之间未见显著性差异,而γδDNT细胞频数在应答组中基线(5.1%,P=0.019)和12W的(5.8%,P=0.041)显著低于非应答组(基线为10.3%,12W为10.4%),而在24W(P=0.071)或52W(P=0.070)的γδDNT细胞频数在应答组与非应答组之间的差别没达到统计学水准,可能是由于应答组中γδDNT细胞有升高的趋势；总的γδT细胞在各组间的统计学比较结果与γδDNT细胞类似,CD4+/CD8+γδT在应答组和非应答组之间没有统计学差异,提示γδT细胞频数的差异主要由γδDNT细胞所决定。另外,EFFORT临床试验中,基线HBeAg半定量水平的中位数在应答者(n=12)中低于非应答者(n=18),但两组之间没有统计学差异(P=0.075),HBeAg水平与γδDNT细胞之间不相关(r=-0.02,P=0.930)单变量logistic回归分析显示HBeAg血清学转换与γδDNT细胞(P=0.040)和HBV-DNA(P=0.005)均有相关,但多变量分析中,只有HBV DNA(P=0.008)有显著效应,而y8DNT细胞(P=0.075)只有独立效应趋势,两者间没有交互作用(P=0.77)。在本研究队列中,应用受试者工作特征曲线(ROC曲线)方法分析显示基线γδDNT细胞频数能预测LDT治疗后52周的应答者(AUC=0.696,P=0.019), γδDNT细胞占CD3+T细胞频数用于预测应答者最优的cut-off值为7.65%,相应的灵敏度是70.0%,特异度为71.0%,最高的阳性预测值是87.8%,对应的γδDNT细胞频数为4.8%,最高的阴性预测值是71.4%,对应的γδDNT细胞频数为15.2%,γδDNT细胞在12w的频数或总的γδT细胞的统计学分析结果与基线的γδDNT细胞频数类似,而HBVDNA水平的ROC曲线分析显示,HBVDNA同样可预测应答者(AUC=0.76,P=0.002)。3.肝内的DNT细胞：从26例LDT治疗超过72周的CHB患者(9例为应答者,17例为非应答者)中分离出LIL,与同期获取的PBMC一起进行抗体标记,流式分析DNT的相关细胞亚群。经Spearman相关分析,αβDNT细胞(r=0.505,P>0.001)和γδDNT细胞(r=0.231,P=0.020)在肝内的频数均与外周血中的频数存在正相关关系,比较外周血之间采用Wilcoxon matched pairs test,比较应答组和非应答组采用Mann-Whitney U test。所有患者中αβDNT细胞频数在肝内显著高于外周血(P<0.001),在应答组(PBL:0.90%,LIL:1.4%, P=0.028)或非应答组(PBL:1.00%,IL:2.10%,P=0.001)也是肝内高于外周血,外周血和肝内比较应答组和非应答组没统计学差异(PBL:P=0.957; LIL:P=0.293);γδDNT细胞(图D)在所有患者中的肝组织和外周血中频数则没有统计学差异(P=0.107),非应答组中肝内与外周血之间也没有统计学差异(P=0.407),但在应答组中,肝内高于外周血(P=0.021),外周血中非应答组(6.5%)显著高于应答组(4.4%,P=0.019),在肝组织中尽管在应答组与非应答组之间没有统计学差异(P=0.067),但其中位数在非应答组(8.4%)中高于应答组(5.2%),基本与外周血一致。4.CHB患者中γδDNT细胞对CD8+T细胞功能的影响。4.1γδDNT细胞对HBV特异性CD8+T细胞应答的影响：分离γδDNT细胞时,鉴于CD4+γδT细胞占γδT细胞不到1%,暂忽略不计,CD8+γδT细胞占γδT细胞27%(10%-52%),采用磁珠分选的办法去除CD8+γδT细胞,但由于CD8+γδT细胞上的CD8分子呈弱表达,难于完全纯化,共来自于8例CHB患者,经纯化后γδDNT细胞在γδT细胞中的纯度为88.9%(86.1%-96.1%),γδT(-)PBMC中αβCD8+T细胞产生的IFNγ频数在Core组显著高于空白刺激组(blank组,P=0.012)和阴性对照组(Gag组,P=0.017),即能检测到HBV特异性的CD8+T细胞应答,γδDNT细胞以1：2的比例掺回γδT(-)PBMC后,αβCD8+T细胞产生的IFNγ频数显著下降(P=0.012)4.2不同γδT细胞频数对HBV特异性CD8+T细胞应答的影响：选择γδDNT/γδT>80%的患者,共4例,采用磁珠分选方法分离γδT细胞,以γδT细胞替代γδDNT细胞进行探讨,γδT细胞与TCRγδ(-)PBMC以0：8、1：8、1：4和1：2混合,随着γδδT细胞比重的增加,γδDNT细胞比重增加,Core诱导αβCD8+T细胞产生IFN-γ (Friedman test, P=0.026)和TNF-α (Friedman test,P=0.044)的细胞频数下降。4.3不同γδT细胞频数对CD8+T细胞非特性活化产生IFN-γ的影响：γδT细胞(γδDNT/γδT>80%)与TCRγδ(-)PBMC以0:16、1:16、1:4、1:2和1：1混合,随着γδT细胞的比重的提高,γδDNT细胞增加,anti-CD3诱导的CD8+T细胞产生IFN-γ能力下降(Friedman test,P=0.007,n=4)。4.4不同γδT细胞频数对CD8+细胞非特异性增殖的影响：γδT细胞(γδDNT/γδT>80%)与CFSE标记的TCRγδ(-)PBMC以0:16、1:16、1:4、1:2和1：1混合,以CD4+T细胞为对照,随着γδT细胞的比重的提高anti-CD3诱导的CD8+T细胞的增殖百分比下降(Friedman test,P=0.003,n=4)。5.CHB中DNT细胞的免疫学特征：比较CD69和HLA-DR在αβDNT细胞、γδDNT细胞和CD4+/CD8+T细胞之间的表达频数,αβDNT细胞显著高表达活化分子CD69(overall P>0.001)和HLA-DR(overall P=0.001);比较CD69和HLA-DR在αβDNT细胞和γδDNT细胞上的表达频数早HC(n=13)、CHB(n=12)和IT(n=9)之间的差别,CHB中CD69在αβDNT细胞(P=0.007)和γδDNT细胞(P=0.008)的表达均高于HC组(n=13),而γδDNT细胞在CHB(P=0.007)和IT(P=0.001)中更多表达HLA-DR,提示DNT细胞亚群在CHB中活化程度更高。在CHB中,αβDNT细胞表达PD-1(n=5, overall P=0.015)和PD-L1(n=5,overall P=0.021)的频数比起γδDNT细胞或CD8+T细胞都高,而γδDNT细胞表达的CD160或BTLA频数比其他细胞亚群高(n=5, overall P=0.009), NKG2A在γδDNT细胞的表达频数甚至比NK细胞都高(n=7,P=0.018),在γδDNT细胞上的各抑制分子表达频数在CHB和HC之间暂没发现有显著差异(n≤7,数据未显示),另外各DNT细胞亚群未测及明显的LAG-3、FasL和CD107的表达。对潜在的细胞因子分泌功能研究中,10例CHB的全血中有5例在无体外刺激下测及αβDNT细胞能产生TGF-β,而IFN-γ、IL-21、IL-10或IL-17未测及；在PMA刺激下,所有患者的αβDNT细胞均能产生TGF-γ,少量产生IFN-γ、相反γδDNT细胞能显著产生IFN-γ,而未测及明显的IL-10、IL-21或IL-17。6.重组表达HBeAg (rHBeAg)体外刺激能提高非应答者来源的γδDNT细胞频数。15例非应答者来源的PBMC在rHBeAg刺激培养下与空白刺激(P=0.029)和rHBcA刺激(P=0.004)比较,rHBeAg能提高增殖T细胞中γδDNT细胞频数,而对αβDNT细胞(P=0.262)或CD4+/CD8+γδT细胞(P=0.175)没有显著影响；在11例应答者来源的PBMC中,αβDNT细胞和γδDNT细胞在空白刺激、rHBcAg和rHBeAg之间的没有统计学差异。结论1.外周血αβDNT细胞频数与LDT治疗52周后的血清学转换不相关,但其在CHB组中高于HC组和IC组,CHB中αβDNT细胞活化的程度较高,突出高表达PD-1和PD-L1分子,是分泌TGF-β的主要细胞群,提示在CHB中起免疫调节作用。2.本研究的重要发现的是γδDNT细胞与对HBV免疫控制相关,横向研究和纵向研究提示高水平γδDNT细胞不利于对HBV的免疫控制。3.本研究中,LDT治疗过程中基线和12w低水平γδDNT频数可预测抗病毒治疗的疗效。4.体外实验进一步提示γδDNT细胞能抑制非特异性的CD8+T细胞应答和HBV特异性CD8+T细胞应答,且γδDNT频数越高,抑制程度越大,一定程度上解释了临床研究中不同γδDNT细胞频数对HBV免疫控制的影响。5.γδDNT细胞突出表达免疫共抑制分子CD160、BTLA和NKG2A,与其免疫抑制作用可能相关。6.体外实验初步发现rHBeAg能提高非应答者中γδDNT细胞的频数,而对应答者则没影响,结合临床治疗过程中应答者γδDNT细胞没有明显变化,可能的解释是非应答者体内有一群HBeAg敏感的γδDNT细胞,但临床研究提示病毒因素对γδDNT细胞的影响可能不是主要因素。