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目的以Raji细胞（Burkitt淋巴瘤细胞）为模型,研究嵌合抗原受体T细胞（Chimeric Antigen Receptor T cell,CAR-T）靶向CD19疗法治疗过程中,B淋巴白血病细胞表面CD19抗原靶点丢失的内在分子机制,为临床治疗提供新的理论支持。方法1、取健康志愿者外周血提取PBMC,使用anti-CD3/CD28磁珠和IL-2刺激T细胞增殖,转导CD19 CAR病毒制备CD19 CAR-T细胞,抗体标记CAR,流式细胞仪检测CAR转导阳性率。稳定制备CAR-T细胞。2、确定CD19 CAR感染阳性率后按阳性率1:1与Raji细胞共培养12h,验证CAR-T细胞靶向CD19攻击B淋巴瘤Raji细胞的杀伤效果,流式细胞术评估Raji细胞CD19下调以及CD19下调导致的阴性复发情况。确定CAR-T杀伤效果,确定Raji细胞CD19抗原丢失。3、细胞共培养12h,共6组,其中Raji组3组,CAR-T共培养Raji细胞、T细胞共培养Raji细胞和阴性对照Raji。CAR-T组3组,分别为Raji CD19抗原刺激CAR激活CAR-T细胞、CD3/CD28抗体刺激TCR激活CAR-T细胞和阴性对照未激活CAR-T细胞。两大组各三小组共培养后抗体标记,流式分选抗体CD8分选T细胞和CAR-T细胞、CD22分选Raji细胞,TRIzol提取分选后细胞的总RNA,进行ONT全长转录组测序。检测共培养后Raji细胞及CAR-T细胞的转录组表达差异。4、分析测序数据,使用edge R进行样品组间的差异表达分析。在差异表达转录本筛选过程中,以|log2FC|≥1,FDR＜0.05为筛选条件。差异倍数（Fold Change FC）表示两组间表达量的比值,取其以2为底的对数的绝对值则为|log2FC|。FDR值（Corrected P-value）为差异表达基因显著性筛选指标。在GO富集分析中,以p值＜0.05为显著富集。使用KEGG数据库进行通路富集分析,以p值＜0.05为通路有显著差异。5、采用实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR,q PCR）法验证测序结果,以p＜0.05筛选与实验相关通路,选择其中的差异基因进行验证。6、使用放线菌酮（Cycloheximide CHX）验证CAR-T是否导致Raji细胞CD19抗原蛋白半衰期下调,使用CCK-8验证Raji细胞和CAR-T细胞最佳CHX作用浓度和作用时间,实验组分为Raji细胞CAR-T共培养加CHX和Raji细胞T细胞共培养加CHX,对照两组不加CHX。结果1、稳定制备具有杀伤能力的CD19 CAR-T细胞,并建立了CD19 CAR-T治疗阴性复发模型。健康志愿者外周血提取T细胞慢病毒感染CD19 CAR,并流式检测CAR阳性率。根据流式细胞仪抗体标记分析结果,未共培养Raji细胞的CD19阳性率均大于99%,与CAR-T细胞按阳性率1:1共培养12小时后,三组重复中Raji细胞CD19阳性率分别下降至29.91%、6.17%和3.15%,t检验分析p＜0.05,有统计学意义。流式分选仪细胞计数CD19-细胞数从平均0.11*105个上升到杀伤后平均15.56*105个,确定是由于CAR-T杀伤导致CD19丢失成为CD19-细胞而不是CD19+死亡只剩下CD19-细胞且CD19-细胞保持CD22+,以判断细胞存活状态。2、ONT三代全长转录本测序结果分析与野生型Raji细胞相比,CAR Raji组差异表达转录本1390个（筛选条件|log2FC|≥1,FDR＜0.05）。其中上调911个（65.54%）下调479个（34.46%）。KEGG通路富集分析显示差异表达转录本主要富集在坏死性凋亡、NF-kappa B信号通路、氧化磷酸化、抗原加工和呈递等通路中。与T细胞共培养Raji细胞相比,CAR Raji组差异表达转录本676个（筛选条件|log2FC|≥1,FDR＜0.05）。其中上调523个（77.37%）下调153个（22.63%）。KEGG通路富集分析差异表达转录本主要富集在坏死性凋亡、碱基切除修复、核糖体、氧化磷酸化等通路中。与未激活CAR-T相比,CD19 CAR激活的CAR-T共有差异表达转录本10084个（筛选条件|log2FC|≥1,FDR＜0.05）。其中上调转录本5769个（57.21%）下调转录本4315个（42.79%）。KEGG通路富集分析显示差异表达转录本主要富集在细胞凋亡、核糖体、氧化磷酸化等通路中。与将TCR激活的Raji细胞相比,CD19 CAR激活的CAR-T组筛选获得差异表达转录本566个,其中上调转录本316个（55.83%）下调转录本250个（44.17%）。KEGG富集分析显示差异表达转录本主要富集在RNA降解、坏死性凋亡、细胞凋亡、剪接体通路中。3、差异表达基因验证根据测序结果,选择出可能与肿瘤免疫逃逸相关11个基因验证测序结果,经q PCR验证,表达差异与测序结果相符。4、CAR-T通过影响蛋白稳定性介导CD19表面抗原丢失我们在ONT测序中共检测得到CD19三个转录本;其表达水平下降均小于2倍,然而这与CD19蛋白水平显著下调不符,提示CD19的降解可能是发生在转录后事件。因此我们通过CCK-8实验明确CHX最佳最低作用浓度为40m M/m L,使用CHX分别作用于T细胞共培养Raji和CAR-T共培养Raji 4h和8h。根据Western Blot结果显示,CAR-T的作用导致Raji细胞CD19抗原蛋白半衰期缩短、稳定性降低。结论成功制备具有杀伤能力的CAR-T细胞并验证CAR-T杀伤会导致Raji细胞CD19蛋白水平下调。通过测序手段检测CD19转录水平的下调情况,测序结果显示CD19转录本表达水平下降均小于2倍,转录本表达下调程度不足以完全解释CD19蛋白表达的缺失,确定CD19转录水平的下调会导致CD19蛋白表达的下降,但并不是全部因素。根据测序结果我们推测,经CAR-T杀伤后,Raji细胞转录水平发生的改变可能就是导致阴性的重要因素之一,CAR-T经由CAR激活而不是传统TCR激活也会导致大量转录水平的改变,或许也是促进Raji细胞阴性复发的原因之一。同时蛋白层面上,根据WB结果显示,CAR-T的靶向杀伤会导致Raji细胞CD19的半衰期缩短、稳定性降低,也可能是Raji细胞CD19抗原丢失的重要原因之一。