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猪支原体肺炎又称猪气喘病或者猪地方流行性肺炎,分布广泛,以慢性、高度接触性、传染性、高发病率及低死亡率等为特点。目前,商品化预防猪支原体肺炎的疫苗主要是兔化弱毒苗、灭活苗以及亚单位疫苗。而现有疫苗存在着成本较高、免疫途径不便、免疫效果不佳等缺陷。新型疫苗即亚单位疫苗以及基因工程活疫苗的研制也就成为较为理想的研究方向。猪肺炎支原体的p36、p46、p65、p97和Nrdf基因是其保护性抗原,也是优秀的疫苗候选抗原。本研究拟通过基因工程相关技术,大量地获得猪肺炎支原体p36、p46、p65和p97R1-Nrdf1的重组蛋白,从而制备相应的猪支原体肺炎亚单位疫苗,以期解决传统亚单位疫苗抗原制备难的问题。而近年来的研究证实,减毒沙门氏菌作疫苗载体具有有效递呈抗原、诱发细胞和粘膜免疫、成本低廉、副作用低等优点。本研究拟将抗原基因p36、p46、p65和p97R1-Nrdf克隆至无抗性的原核表达质粒,成功构建了能够有效表达外源抗原的无抗性重组减毒猪霍乱沙门氏菌,并对重组菌株进行初步评价,为猪支原体肺炎的防治奠定了基础。目前,用于检测猪肺炎支原体的诊断方法中分离培养很难,且需时长,检出率低；间接血凝试验存在抗原难保存的问题；PCR技术条件要求高,易呈假阴性和假阳性,检测成本也高；ELISA由于猪肺炎支原体与猪鼻支原体、絮状支原体存在共同抗原,导致非特异性交叉反应增加。而单抗可特异性地提高抗原抗体的反应,使交叉反应减少,从而保证试验结果的准确性。主要研究内容如下：1.猪肺炎支原体亚单位疫苗的研制根据Gene-Bank中的已知序列设计引物,扩增p46和p65蛋白基因,将该片段克隆至表达质粒pGEX-KG,得到重组质粒pGEX-46和pGEX-65。利用定点突变以及重组表达技术获得猪肺炎支原体主要免疫原膜蛋白p46和p65。将p46和p65蛋白与实验室之前构建表达的p36蛋白组合,从而制备相应猪支原体肺炎亚单位疫苗。为了进一步提高猪支原体肺炎亚单位疫苗的免疫效果,本试验还将串联重组表达的p97R1-Nrdf蛋白与p36、p46和p65蛋白组合在一起,制备了另外一种含5种蛋白的猪支原体肺炎亚单位疫苗,以期达到更好的免疫效果。设立以重组蛋白p36、p46和p65为试验Ⅰ组,p36、p46、p65和p97R1-Nrdf为试验Ⅱ组,猪支原体疫苗安百克(M+PAC)为试验Ⅲ组,PBS+佐剂为空白对照组来免疫BALB/c小鼠。检测小鼠血清、肺脏及经蛋白刺激脾淋巴细胞的猪肺炎支原体抗体、IFN-γ以及IL-4。试验结果为：试验Ⅱ组的猪肺炎支原体抗体水平极显著高于试验Ⅰ组、Ⅲ组(P<0.01)；试验Ⅱ组的IFN-y水平极显著高于试验Ⅲ组,而试验Ⅱ组与Ⅰ组、试验Ⅰ组与Ⅲ组的IFN-y水平均无显著差异(P<0.05)；试验Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组的IL-4水平差异不显著(P<0.05),但都极明显高于对照组(P<0.01)；肺的检测结果中猪肺炎支原体抗体、IFN-y和IL-4水平呈现一致性,为试验Ⅱ组>试验Ⅰ组>试验Ⅲ组>对照组；而经刺激的脾淋巴细胞检测结果则为试验Ⅱ组的猪肺炎支原体抗体和IFN-y水平最高,而IL-4水平为试验Ⅲ组最高。由此可见,大肠杆菌所表达的蛋白具有良好的免疫原性,可以诱导小鼠产生较好的免疫效果,结果显示这两种亚单位疫苗在激活体液免疫的同时也激活了细胞免疫。其中,试验Ⅱ组通过体液免疫和细胞免疫途径,所产生的猪支原体肺炎的抗体水平最高；试验Ⅰ组亦能够通过这两种免疫途径达到与试验Ⅲ组同样的免疫效果。2.猪肺炎支原体基因工程活疫苗的研制根据Gene-Bank中的已知序列设计引物,并利用分子克隆技术将能够原核表达的猪肺炎支原体p46和p65基因克隆至表达质粒pYA3493中,得到重组质粒pYA-46和pYA-65。重组质粒和pYA3493分别电转入asd基因缺失株的猪霍乱沙门氏菌C500-,制备重组菌株C46(pYA-46)和C65(pYA-65)以及空载体对照菌株CpYA(pYA3493)。Western-blot结果显示p46和p65基因能在重组菌株中表达。研究结果显示,重组菌株C46(pYA-46)和C65(pYA-65)与亲本菌株C500相比,其生化和生长特性未发生改变,插入的外源基因能分泌表达亦稳定存在。将重组菌株C46和C65与实验窒构建的重组菌株C36(pYA-36)组合制备基因工程活疫苗,同时再与C97R1-Nrdf(pYA-97R1-Nrdf)结合制备另一种表达5种免疫原性蛋白的基因工程苗,并以小鼠为动物模型评价重组菌株在口服、肌注两种不同免疫途径的免疫原性。疫苗对小鼠的免疫原性结果显示：口服C36+C46+C65+C97R1-Nrdf组猪肺炎支原体抗体极显著高于口服C36+C46+C65组和肌注商品疫苗组(P<0.01),但与肌注C36+C46+C65组无显著差异(P>0.05)；IFN-γ则为肌注C36+C46+C65组显著高于肌注商品疫苗组(P<0.05),而与口服C36+C46+C65组或C36+C46+C65+C97R1-Nrdf组之间的差异均不显著(P>0.05)；IL-4的水平则呈现出口服C36+C46+C65组>口服C36+C46+C65+C97R1-Nrdf组>肌注商品疫苗组>肌注C36+C46+C65组,但各组之间的差异均不显著(P>0.05)。各对照组的猪肺炎支原体抗体、IFN-y以及IL-4均与试验组差异极显著(P<0.01)。由此可见,所构建的表达猪肺炎支原体免疫原性基因的重组沙门氏菌,对小鼠具较好免疫原性,且采用肌注时其免疫原性更好,有望发展为猪支原体肺炎的基因工程疫苗。3.抗猪肺炎支原体p36蛋白单克隆抗体的制备与应用利用本实验室构建的含pGEX-36质粒的大肠杆菌经IPTG诱导,谷胱甘肽琼脂糖凝胶对可溶性蛋白的纯化,得到融合蛋白GST-36。将重组蛋白采取常规皮下免疫和腹腔加强免疫相结合的方式免疫BALB/c小鼠。SP2/0骨髓瘤细胞与免疫小鼠脾细胞融合,经ELISA筛选,5次有限稀释法克隆,获得了19株抗猪肺炎支原体p36蛋白的的杂交瘤细胞。Western-blot结果显示,单克隆抗体能够与p36蛋白发生特异性反应。经检测细胞培养上清的效价最为1：25600至1：51200,小鼠腹水效价为1：13107200至1：52428800；抗体亚型分别为IgG2b和IgG1,轻链为K型。单克隆抗体的制备为准确而特异诊断猪肺炎支原体的免疫组化方法的建立提供了保障。利用制备的抗猪肺炎支原体p36蛋白的单克隆抗体作为一抗,建立单抗免疫组化方法用于检测空白攻毒组、阴性对照组组以及临床疑似病例的猪肺组织。试验结果显示,该免疫组化方法定位准确且成本较低,比PCR方法更具准确性。同时进一步证实本试验得到的抗猪肺炎支原体p36蛋白的单克隆抗体具有较好的特异性,从而使抗原抗体特异性反应,减少交叉反应,使试验的结果更加准确而特异。