剪接体是执行pre-m RNA剪接功能的分子机器,超过95%的真核生物基因在转录后需要经过pre-m RNA剪接,移除内含子并拼接外显子,从而形成成熟的m RNA用以指导蛋白质合成。pre-m RNA剪接是一个高度复杂且精细调控的过程,对于系统发育及组织稳态的维持至关重要。pre-m RNA剪接功能缺陷往往会导致人类视网膜、造血谱系、颅面骨骼、脊髓及四肢等组织器官疾病的发生。剪接因子已被证明在造血系统发育过程中具有至关重要的作用,但其具体调控机制尚不清楚。前体m RNA加工因子31（pre-m RNA processing factor 31,PRPF31）是一种U4小核核糖核蛋白（small nuclear ribonucleoproteins,sn RNPs）,作为剪接因子通过促进U4/U6·U5 tri-sn RNPs的组装和稳定性参与pre-m RNA剪接过程。人类PRPF31基因突变导致常染色体显性视网膜色素变性,但迄今为止尚无PRPF31参与造血系统发育过程的报道。斑马鱼作为一种经典的模式生物,被广泛用于造血系统发育的研究。本研究应用斑马鱼模型,探索斑马鱼prpf31基因在造血系统发育过程中的功能及其调控机制。应用原位杂交技术检测斑马鱼prpf31基因在胚胎发育早期阶段的表达情况,发现该基因在斑马鱼胚胎发育早期的一系列初级造血、次级造血及血管区域均存在显著表达,提示Prpf31可能参与造血系统及血管发育过程。应用prpf31基因敲除的斑马鱼模型,通过原位杂交技术观察Prpf31在斑马鱼造血系统发育过程中的作用,发现prpf31基因敲除斑马鱼能够正常进行初级造血以及红髓祖细胞造血过程,但在次级造血过程中prpf31基因敲除斑马鱼尾部造血组织（caudal hematopoietic tissue,CHT）中造血干祖细胞（hematopoietic stem and progenitor cells,HSPCs）及由其分化产生的各类血细胞的发育均严重受损。进一步通过原位杂交以及荧光斑马鱼实时成像技术对HSPCs的产生、迁移、定植以及扩增和维持过程进行追踪观察,发现prpf31基因敲除斑马鱼能够正常进行HSPCs的产生、迁移及定植,但其在CHT区的扩增和维持存在严重缺陷。通过原位杂交以及荧光斑马鱼实时成像技术观察prpf31基因敲除斑马鱼的血管发育情况,发现prpf31基因敲除斑马鱼能够正常进行血管生成,且具有完整的血管结构,提示次级造血过程中CHT区HSPCs的扩增和维持缺陷可能与prpf31基因敲除斑马鱼的血管生成和血管结构无关。上述结果说明prpf31基因敲除特异性的导致HSPCs在CHT区的扩增、维持及分化受损。为探索prpf31基因敲除导致HSPCs在CHT区扩增、维持及分化缺陷的分子机制,本研究通过荧光标记技术检测HSPCs在CHT区的凋亡和增殖情况。TUNEL染色显示,prpf31基因敲除斑马鱼CHT区的HSPCs并未发生过度凋亡的情况。Ed U染色和p H3染色显示,prpf31基因敲除对斑马鱼CHT区HSPCs有丝分裂S期DNA的合成无显著影响,但导致CHT区HSPCs在M期发生阻滞,提示HSPCs的M期阻滞是导致HSPCs发育和分化缺陷的原因。为阐明prpf31基因敲除导致HSPCs发生M期阻滞的原因,本研究通过转录组测序,对差异可变剪接基因进行基因本体论功能富集分析。数据显示在prpf31基因敲除斑马鱼中,涉及染色质组织、细胞周期调控以及微管依赖性进程等多个有丝分裂进程相关通路的基因发生显著异常可变剪接。通过半定量反转录PCR对涉及这三个有丝分裂进程相关通路富集到的可变剪接事件进行验证,结果基本与转录组测序结果一致,提示prpf31基因敲除导致广泛的有丝分裂进程相关基因的异常可变剪接,这可能是导致HSPCs发生M期阻滞的原因。进一步通过微管蛋白Tubulin染色观察HSPCs的有丝分裂状态,发现prpf31基因敲除斑马鱼CHT区HSPCs在有丝分裂前中期表现出纺锤体微管排列紊乱以及染色质凝集度低等异常的有丝分裂形态。原位杂交结果显示,四个参与血液系统疾病发生且已被本文证实存在异常可变剪接的有丝分裂相关基因（septin6,smarcb1b,tinf2,usp22）,在prpf31基因敲除斑马鱼CHT区的表达水平显著下调,提示Prpf31可能是通过调控HSPCs有丝分裂进程相关基因的可变剪接来定义HSPCs的有丝分裂状态,进而参与HSPCs的扩增、维持及分化过程。综上所述,本研究首次发现Prpf31参与造血系统发育过程,并阐释Prpf31参与造血系统发育过程的分子机制。Prpf31通过介导有丝分裂进程相关基因的可变剪接来调控HSPCs的有丝分裂状态,进而参与HSPCs的扩增、维持及分化过程。本研究挖掘了Prpf31新的生理功能,为阐明剪接因子参与造血系统发育过程的机制研究提供了全新的认知角度。