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周围神经损伤常引起病理性疼痛,表现为顽固性的痛觉过敏,包括痛超敏(allodynia,痛阈显著下降)、痛敏(hyperalgesia,痛反应增强)和自发性疼痛。多年来,尽管国内外已经进行了大量研究,但病理性疼痛的机制仍然不十分清楚。长时程增强(long-term potentiation,LTP)现象最早发现于海马,是突触传递效率增强的表现,被认为是神经系统信息储存以及学习记忆的基础。脊髓背角C-纤维诱发电位的LTP是初级传入C-纤维与脊髓背角浅层神经元的一种活动依赖性兴奋性突触传递效率增强的表现。我们之前的研究证明电刺激初级传入C纤维或者急性末梢神经损伤可以引起脊髓背角C纤维诱发电位的LTP。由于C纤维传递痛觉信号并且与脊髓背角浅层神经元形成突触联系,而且Klein等报导在人体用引起脊髓背角LTP的强直电刺激兴奋皮肤肽能C纤维引起原发性痛觉过敏(发生在电刺激部位)和继发性痛觉过敏和超敏(发生在电刺激临近部位)。因此越来越多的学者认为脊髓LTP是一种痛觉记忆。
神经损伤后脊髓小胶质细胞的激活对病理性疼痛的产生至关重要。活化的小胶质细胞可能通过释放致炎细胞因子,比如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)引起痛觉过敏。我们最近的研究表明神经损伤后TNF-α对病理性疼痛的产生十分重要。然而,激活的小胶质细胞是否影响并且如何影响C纤维介导的突触可塑性还不清楚。酪氨酸家族激酶(Src-family kinases,SFKs)广泛的表达在哺乳动物的中枢神经系统(central nervous system,CNS)并且参与了中枢神经系统的增生与分化。末梢神经损伤可以激活脊髓背角的SFKs,活化的SFKs只在小胶质细胞而不在神经元或星形胶质细胞中表达。鞘内注射SFKs的抑制剂PP2可以抑制神经损伤引起的机械性痛觉过敏。这些结果都表明脊髓小胶质细胞中的SFKs对病理性疼痛的产生十分重要。小胶质细胞,SFKs,TNF-α三者都在病理性疼痛的产生中发挥重要作用,那这三者对脊髓背角C纤维介导的突触可塑性有何影响,它们之间的关系又是什么就是本研究的目的。
第1章:小胶质细胞的抑制剂对脊髓背角突触可塑性的影响。
本研究在成年SD大鼠的脊髓背角浅层(100-550μm),用钨丝微电极记录C纤维诱发电位的LTP。在高频刺激(HFS)坐骨神经诱导脊髓背角LTP前60分钟,脊髓背角表面给予小胶质细胞的抑制剂美满霉素。研究小胶质细胞在脊髓背角LTP诱导中的作用。我们发现美满霉素剂量依赖性的影响脊髓背角突触可塑性。(1)高频刺激前60min脊髓表面给予美满霉素(50μM,200μl,n=5),不影响LTP的诱导;(2)高频刺激前60min脊髓表面给予美满霉素(100μM,200μl,n=5),LTP被完全阻断;(3)高频刺激前60min脊髓表面给予美满霉素(200μM,200μl,n=5),LTP被翻转为LTD;(4)美满霉素(200μM,200μl,n=5)本身不影响C纤维的基础电位;(5)美满霉素的溶剂DMSO(0。4%)对C纤维的基础电位(n=5)和LTP的诱导(n=5)都没有影响。以上结果提示活化的小胶质细胞控制脊髓背角C纤维突触可塑性的方向,而对基本突触传递没有影响。
第2章:SFKs的抑制剂对脊髓背角突触可塑性的影响。
末梢神经损伤后脊髓小胶质细胞中的SFKs大量激活从而引起病理性疼痛。因此本研究设计在高频刺激坐骨神经前,脊髓背角表面给予SFKs的抑制剂PP2或SU6656来验证SFKs对脊髓背角突触可塑性的作用。实验结果表明:(1)SFKs的特异性抑制剂PP2(100μM)不影响C纤维的基础电位(n=5)但是可以使高频刺激诱导出LTD而不是LTP(n=5)。(2)SFKs的广谱抑制剂SU6656(200μM)不影响C纤维的基础电位(n=5)但是也可以使高频刺激诱导出LTD而不是LTP(n=5)。这些结果表明活化的小胶质细胞可能通过激活SFKs控制突触可塑性的方向。
第3章:高频刺激诱导出脊髓背角LTP后,脊髓小胶质细胞中的SFKs大量激活。
为了进一步验证小胶质细胞中的SFKs在脊髓突触可塑性中的作用,我们用Western blotting的方法测试了高频刺激诱导出LTP的不同时间点上磷酸化SFKs的表达情况。结果表明:(1)高频刺激坐骨神经诱导出脊髓LTP后,刺激同侧脊髓背角的磷酸化SFKs(p-SFKs)表达与正常动物以及对照组动物(只做电生理记录基础电位而未给高频刺激诱导LTP的动物)相比明显增加。(2)LTP诱导后15,30分钟,脊髓背角磷酸化SFKs大量表达,而到60分钟的时候回到对照组水平。为了确定诱导LTP后,脊髓背角磷酸化的SFKs表达的细胞学定位,我们用电生理方法诱导出脊髓LTP15分钟后,取大鼠脊髓腰膨大部位切片做免疫荧光双染,发现磷酸化的SFKs只在脊髓背角的小胶质细胞中表达。以上结果表明高频刺激诱导出LTP后,脊髓背角小胶质细胞中的SFKs大量激活。
第4章:肿瘤坏死因子在脊髓LTP的诱导中起重要作用。
以前的研究表明活化的小胶质细胞通过释放肿瘤坏死因子-α(TNF-α)引起病理性疼痛。本实验验证了活化的小胶质细胞是否就是通过释放TNF-α来易化LTP的诱导。结果表明:(1)在抑制小胶质细胞或者SFKs后,脊髓表面给予重组TNF-α(0。5 ng/ml,200μl;n=6),高频刺激可以诱导出LTP;(2)正常小鼠高频刺激坐骨神经可以引起脊髓LTP(n=5),而肿瘤坏死因子受体-1(TNFR1)基因敲除小鼠上,高频刺激无法诱导脊髓LTP(n=6);(3)高频刺激前30分钟脊髓表面给予TNF-α中和抗体(0。6μg/ml,200μl;n=6),脊髓LTP被完全抑制。(4)TNF-α和TNF-α中和抗体的溶剂PBS(0。01M,200μl)对C纤维的基础电位(n=5)和LTP的诱导(n=5)都没有影响。以上结果表明活化的小胶质细胞中释放的TNF-α对脊髓LTP的诱导至关重要。
结论:
⑴脊髓的小胶质细胞控制了脊髓背角突触可塑性的方向,但不影响基本突触递。小胶质细胞激活的时候,高频刺激正常大鼠坐骨神经可以在同侧脊髓背角诱导出长时程的LTP,小胶质细胞被抑制时候,高频刺激大鼠坐骨神经可以在同侧脊髓背角诱导出长时程的LTD。
⑵脊髓中小胶质细胞通过酪氨酸家族激酶SFKs控制脊髓背角突触可塑性的方向。
⑶高频刺激坐骨神经诱导脊髓LTP后,脊髓背角SFKs的磷酸化表达与未诱导LTP的动物相比明显增加,并且活化的SFKs只存在于脊髓小胶质细胞中。
⑷脊髓中小胶质细胞活化后释放的TNF-α对脊髓LTP的诱导至关重要。