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黄瓜(Cucumis sativus L.),为葫芦科甜瓜属,是世界性重要蔬菜之一。然而在黄瓜生产中,由于遗传因素和栽培因素作用,会导致黄瓜产生苦味,严重影响黄瓜的商品品质和经济效益。黄瓜苦味是由一种名为葫芦素C的物质引起的。本实验室前期揭示了黄瓜葫芦素C的生物合成是由1个Bi基因,6个P450基因和1个ACT基因组成的基因簇控制(Bi基因簇),Bi基因控制着葫芦素C合成的第一步关键反应。近期,在黄瓜中发现一对自然突变体,即有苦味的野生品种‘XY-2’及其无苦味的自然突变体‘XY-3’,经基因组重测序、生物信息学比较,发现一个单核苷酸多态性(SNP)位于基因Bf上。Bf编码一个bHLH家族转录因子,这个突变碱基位于Bf的内含子剪接位点上,很可能通过改变内含子的剪接方式影响Bf的表达。因此,我们提出一个假设,这个bHLH家族的转录因子Bf调控黄瓜苦味物质—葫芦素C的合成。鉴于黄瓜还没有高效的遗传转化体系,本研究采用黄瓜子叶瞬时转化方法,将外源Bf基因导入Bf突变体‘XY-3’中,验证Bf对黄瓜中葫芦素C的转录调控作用。然后进一步利用酵母单杂交技术,农杆菌渗透法烟草瞬时转化系统,染色质免疫沉淀技术(ChIP),进一步揭示Bf转录因子调控黄瓜中葫芦素C的分子机制,即Bf转录因子特异性结合Bi基因簇启动子区(BCPs)的E-box元件,调控Bi基因簇中各个基因的表达,最终控制黄瓜中葫芦素C的生物合成。主要结果如下：(1)突变体瞬时转化体系验证Bf转录因子调控葫芦素C生物合成的功能：利用黄瓜子叶瞬时转化系统,将Bf基因构建到pCAMBIA1300表达载体上,利用农杆菌渗透法瞬时转化到Bf突变体‘XY-3’的黄瓜子叶中,使‘XY-3’子叶瞬时表达Bf转录因子。结果表明,在Bf突变体‘XY-3’的黄瓜子叶中,Bf基因过表达引起Bi基因簇各基因表达量升高,并最终导致葫芦素C的产生,使Bf突变体‘XY-3’得到互补的表型。(2)酵母单杂交技术验证Bf的转录调控功能：将Bf基因构建到含有GAL4激活结构域(AD)的pGADT7-Rec2效应载体上,与Bi基因簇启动子(BCPs)的pHIS2报告载体进行酵母单杂交试验,结果表明：在最适3-AT浓度下,与对照组相比,Bf转化的酵母菌在SD-Trp-Leu-His固体培养基上明显生长。说明在异源酵母系统中Bf转录因子能够与BCPs特异性结合发挥转录调控功能。(3)烟草瞬时转化体系验证Bf的正调控功能：将Bf基因构建到pCAMBIA1300效应载体上,与BCPs的pCAMBIA1300-LUC报告载体,利用农杆菌渗透法共同转化烟草,定性分析结果显示：实验组烟草叶片中Bf对Luc基因的激活程度明显高于对照组,说明在异源烟草体内Bf转录因子也能够与Luc-BCPs特异结合并激活Luc基因的表达。该系统与酵母单杂交技术互为平行证据,共同证明了Bf转录因子能够直接结合BCPs发挥转录正调控功能。(4) ChIP-qPCR验证Bf与BCPs结合的作用元件：将Bf基因与4个MYC标签融合,构建到pCAMBIA1300载体上,通过农杆菌渗透法携带Bf-4MYC转化到黄瓜Bf突变体‘XY-3’的子叶中,使Bf-4MYC蛋白表达。以处理的子叶为实验材料进行ChIP,以BCPs的E-box区域设计引物进行qPCR检测。结果表明,Bf转录因子能够与8个BCPs的E-box结合。而且,Bf转录因子对于不同的BCPs结合能力不同,对于同一BCPs的不同E-box结合能力也不同。进一步揭示了在黄瓜中,Bf转录因子通过结合BCPs上的E-box转录调控Bi基因簇各基因的表达。