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目的：临床研究：收集CKD3～5期非透析患者的临床资料，综合分析CKD患者中医证候要素分布规律及其与疾病分期和实验室指标的关系，探讨CKD的基本病机和证候特征，为临床辨证论治提供客观依据。实验研究：探讨补气活血中药黄芪-丹参有效单体(毛蕊异黄酮-丹参酮ⅡA)对体外缺血损伤肾小球内皮细胞血管生成的影响及调节机制，为中医药采用补气活血法治疗肾脏疾病提供理论依据。
方法：
1.制定CKD患者中医证素调查表，纳入山东省中医院肾病科2016年12月至2018年10月的CKD3～5期非透析住院患者，采集患者一般资料、现病史、疾病分期、四诊信息和主要实验室指标等，使用SPSS22.0软件对患者基本资料、证素分布等进行统计分析，明确CKD常见中医证候要素分布规律及其与疾病分期和实验室指标的关系，探讨CKD的基本病机和证候特征。
2.毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA及其配伍对缺血损伤HRGEC的保护作用：体外培养人肾小球内皮细胞(HRGEC)，以Earles平衡盐代替正常培养基诱导建立HRGEC缺血模型，采用MTT法筛选毛蕊异黄酮(0.1mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L)和丹参酮ⅡA(0.001mg/L、0.01mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L、1mg/L、10mg/L)保护Earles平衡盐诱导的缺血损伤HRGEC的最佳药物浓度，根据筛选出的最佳作用浓度，两药分设低、中、高3个剂量组，设计正交实验，采用MTT法筛选出两药最佳药物配伍比例；使用最佳作用浓度的毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA及其配伍干预Earles平衡诱导的HRGEC缺血模型，采用MTT实验、凋亡实验、粘附实验、活性氧检测实验观察毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA及其配伍对HRGEC存活率、凋亡、粘附能力、活性氧的影响。
3.毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍干预缺血损伤HRGEC血管生成的研究：采用细胞迁移实验、Matrigel血管生成实验观察毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对体外缺血损伤HRGEC血管生成的影响；采用SeahorseXF细胞能量代谢分析仪观察毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对缺血损伤HRGEC线粒体呼吸功能的影响；采用转录组测序技术检测毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA对缺血损伤HRGECmRNA表达谱的影响，筛选差异基因，使用q-RT-PCR和WesternBlot验证选取的差异基因表达情况。
4.毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对SGK1/TP53/SLC2A3信号通路的调节作用：SGK1抑制剂(EMD638683)抑制HRGECSGK1表达，Western-blot法检测SGK1、TP53、SLC2A3蛋白表达变化。
结果：
1.共纳入185例CKD3～5期非透析患者，男性104例，女性81例，男女比例为1.28:1。年龄介于25岁至92岁之间，平均年龄54.68±14.18岁。原发病中，以慢性肾小球肾炎为主，占36.76%，其次为糖尿病肾病，占22.70%。合并症及并发症中，高血压最为多见，共162例，占87.57%，其次为贫血96例，占51.89%。中医症状频率出现大于20%的依次为倦怠乏力、面色黧黑或晦暗、水肿、肢体困重、面色无华或萎黄、唇甲色淡、食少纳呆、大便溏软、少气懒言、小便清长或夜尿多、脘腹胀满、口干口苦、畏寒肢冷、面色晄白、口咽干燥、恶心呕吐、肢体麻木，活动不灵、便结而尿短赤。中医证候要素构成，以虚实夹杂证最为多见，共149例，占总例数的80.54%，单纯虚证仅占11.89%，单纯实证仅占7.57%；四种虚性证候要素中气虚证最为多见，共123例，占总例数的66.49%，血虚证次之，占45.95%，阳虚证占31.89%，阴虚证最少，占25.41%；四种实性证候要素中血瘀证最为多见，共102例，占总例数的55.14%，湿热证次之，占45.41%，湿浊证占17.84%，水湿证最少，占14.05%；虚实夹杂证候要素中，出现频率前十位的证候要素组合依次为气虚证+血瘀证+湿热证、气虚证+血瘀证、气虚证+血虚证+湿热证、气虚证+湿热证、气虚证+血瘀证+湿浊证、气虚证+血虚证+血瘀证+湿浊证、血虚证+湿热证、气虚证+血瘀证+水湿证、气虚证+阳虚证+血瘀证+水湿证、气虚证+血虚证+血瘀证+湿热证。不同分期CKD患者的证候要素频率分布情况，虚性证候要素：CKD3期依次为：气虚证＞阴虚证＞血虚证＞阳虚证；CKD4期依次为：气虚证＞血虚证＞阳虚证＞阴虚证；CKD5期依次为：气虚证＞血虚证＞阳虚证＞阴虚证；气虚证在CKD各期分布均衡(P＞0.05)，血虚证、阴虚证和阳虚证在CKD各期分布不均衡(P＜0.05)。实性证候要素：CKD3期依次为：血瘀证＞湿热证＞水湿证＞湿浊证；CKD4期依次为：血瘀证＞湿热证＞湿浊证＞水湿证；CKD5期依次为：血瘀证＞湿热证＞湿浊证＞水湿证。血瘀证、湿热证、水湿证在CKD各期分布均衡(P＞0.05)；湿浊证在CKD各期分布不均衡(P＜0.05)。中医证候要素与实验室指标的关系，血红蛋白、血清白蛋白、血肌酐指标在虚性证候要素之间的差异有统计学意义(P＜0.05)，24h尿蛋白定量差异无统计学意义(P＞0.05)。血虚证、阳虚证患者血红蛋白水平明显低于气虚证、阴虚证患者(P＜0.05)；气虚证患者白蛋白水平明显低于血虚证、阴虚证、阳虚证患者(P＜0.05)；血虚证和阳虚证患者血肌酐明显高于气虚证、阴虚证患者(P＜0.05)。血红蛋白、血清白蛋白、血肌酐、24h尿蛋白定量在实性证候要素之间的差异均无统计学意义(P＞0.05)。
2.毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA及其配伍对缺血损伤HRGEC的保护作用：毛蕊异黄酮的最佳作用浓度为10mg/L，丹参酮ⅡA的最佳作用浓度为0.05mg/L，毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍的最佳作用浓度为10mg/L+0.025mg/L；Earles平衡盐诱导的HRGEC缺血损伤使存活率降低，凋亡率升高，粘附能力降低，细胞内活性氧水平升高(P＜0.05)；毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA可提高HRGEC存活率，减少凋亡，降低细胞内活性氧水平(P＜0.05)，两药配伍优于单药(P＜0.05)，丹参酮ⅡA可提高粘附能力(P＜0.05)，毛蕊异黄酮对粘附能力无改善(P＞0.05)。
3.毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍干预缺血损伤HRGEC血管生成的研究：Earles平衡盐诱导的缺血损伤使HRGEC迁移能力降低，成血管能力降低(P＜0.05)，毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍可改善缺血损伤引起的HRGEC迁移能力和成血管能力抑制(P＜0.05)；Earles平衡盐诱导的缺血损伤显著抑制了HRGEC线粒体呼吸能力，可降低基础呼吸、ATP产生能力和呼吸储备，毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍可显著改善缺血损伤HRGEC的线粒体呼吸能力，可提高基础呼吸、ATP产生能力和呼吸储备；毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对缺血损伤HRGEC基因表达谱的影响：模型组与正常组比较，共筛选出差异mRNA3464个，其中2273个上调，1191个下调(q-value≤0.05)；毛蕊异黄酮+丹参酮ⅡA配伍组与模型组比较，共筛选出差异mRNA642个，其中299个上调，343个下调(q-value≤0.05)；选取相关基因进行验证，q-RT-PCR检测SGK1、TP53、MAPK14、SLC2A3、VEGFA、CSmRNA表达，WesternBlot检测VEGFA、CS蛋白表达，验证结果显示各基因表达变化同测序结果趋势基本相同，提示测序结果真实可靠。
4.毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对SGK1/TP53/SLC2A3信号通路的调节作用：Earles平衡盐诱导的HRGEC缺血损伤引起SGK1、SLC2A3蛋白表达显著下调，TP53蛋白表达显著上调(P＜0.05)；毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍干预后SGK1、SLC2A3蛋白表达显著上调，TP53蛋白表达显著下调(P＜0.05)。采用EMD638683抑制SGK1表达后，SGK1、SLC2A3蛋白表达进一步显著下调，TP53蛋白表达进一步显著上调4.毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对SGK1/TP53/SLC2A3信号通路的调节作用：Earles平衡盐诱导的HRGEC缺血损伤引起SGK1、SLC2A3蛋白表达显著下调，TP53蛋白表达显著上调(P＜0.05)；毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍干预后SGK1、SLC2A3蛋白表达显著上调，TP53蛋白表达显著下调(P＜0.05)。采用EMD638683抑制SGK1表达后，SGK1、SLC2A3蛋白表达进一步显著下调，TP53蛋白表达进一步显著上调(P＜0.05)。
结论：临床研究：CKD病机虚实夹杂，气虚证、血瘀证在CKD各期普遍存在，气虚血瘀是CKD的基本病机；血虚证和阳虚证与血红蛋白、血肌酐有一定相关性，气虚证与血清白蛋白有一定相关性。实验研究：毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA对Earles平衡盐诱导的HRGEC缺血损伤具有显著保护作用，可提高细胞存活率，减少凋亡，降低细胞内活性氧水平，两药配伍优于单药，丹参酮ⅡA可提高细胞粘附能力。毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍具有显著促血管生成作用，可提高缺血损伤HRGEC迁移能力和成血管能力，其作用机制可能与调控CS、VEGFA、SGK1、TP53、SLC2A3表达，促进细胞存活，抑制凋亡，增强线粒体呼吸和葡萄糖代谢有关。
方法：
1.制定CKD患者中医证素调查表，纳入山东省中医院肾病科2016年12月至2018年10月的CKD3～5期非透析住院患者，采集患者一般资料、现病史、疾病分期、四诊信息和主要实验室指标等，使用SPSS22.0软件对患者基本资料、证素分布等进行统计分析，明确CKD常见中医证候要素分布规律及其与疾病分期和实验室指标的关系，探讨CKD的基本病机和证候特征。
2.毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA及其配伍对缺血损伤HRGEC的保护作用：体外培养人肾小球内皮细胞(HRGEC)，以Earles平衡盐代替正常培养基诱导建立HRGEC缺血模型，采用MTT法筛选毛蕊异黄酮(0.1mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L)和丹参酮ⅡA(0.001mg/L、0.01mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L、1mg/L、10mg/L)保护Earles平衡盐诱导的缺血损伤HRGEC的最佳药物浓度，根据筛选出的最佳作用浓度，两药分设低、中、高3个剂量组，设计正交实验，采用MTT法筛选出两药最佳药物配伍比例；使用最佳作用浓度的毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA及其配伍干预Earles平衡诱导的HRGEC缺血模型，采用MTT实验、凋亡实验、粘附实验、活性氧检测实验观察毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA及其配伍对HRGEC存活率、凋亡、粘附能力、活性氧的影响。
3.毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍干预缺血损伤HRGEC血管生成的研究：采用细胞迁移实验、Matrigel血管生成实验观察毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对体外缺血损伤HRGEC血管生成的影响；采用SeahorseXF细胞能量代谢分析仪观察毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对缺血损伤HRGEC线粒体呼吸功能的影响；采用转录组测序技术检测毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA对缺血损伤HRGECmRNA表达谱的影响，筛选差异基因，使用q-RT-PCR和WesternBlot验证选取的差异基因表达情况。
4.毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对SGK1/TP53/SLC2A3信号通路的调节作用：SGK1抑制剂(EMD638683)抑制HRGECSGK1表达，Western-blot法检测SGK1、TP53、SLC2A3蛋白表达变化。
结果：
1.共纳入185例CKD3～5期非透析患者，男性104例，女性81例，男女比例为1.28:1。年龄介于25岁至92岁之间，平均年龄54.68±14.18岁。原发病中，以慢性肾小球肾炎为主，占36.76%，其次为糖尿病肾病，占22.70%。合并症及并发症中，高血压最为多见，共162例，占87.57%，其次为贫血96例，占51.89%。中医症状频率出现大于20%的依次为倦怠乏力、面色黧黑或晦暗、水肿、肢体困重、面色无华或萎黄、唇甲色淡、食少纳呆、大便溏软、少气懒言、小便清长或夜尿多、脘腹胀满、口干口苦、畏寒肢冷、面色晄白、口咽干燥、恶心呕吐、肢体麻木，活动不灵、便结而尿短赤。中医证候要素构成，以虚实夹杂证最为多见，共149例，占总例数的80.54%，单纯虚证仅占11.89%，单纯实证仅占7.57%；四种虚性证候要素中气虚证最为多见，共123例，占总例数的66.49%，血虚证次之，占45.95%，阳虚证占31.89%，阴虚证最少，占25.41%；四种实性证候要素中血瘀证最为多见，共102例，占总例数的55.14%，湿热证次之，占45.41%，湿浊证占17.84%，水湿证最少，占14.05%；虚实夹杂证候要素中，出现频率前十位的证候要素组合依次为气虚证+血瘀证+湿热证、气虚证+血瘀证、气虚证+血虚证+湿热证、气虚证+湿热证、气虚证+血瘀证+湿浊证、气虚证+血虚证+血瘀证+湿浊证、血虚证+湿热证、气虚证+血瘀证+水湿证、气虚证+阳虚证+血瘀证+水湿证、气虚证+血虚证+血瘀证+湿热证。不同分期CKD患者的证候要素频率分布情况，虚性证候要素：CKD3期依次为：气虚证＞阴虚证＞血虚证＞阳虚证；CKD4期依次为：气虚证＞血虚证＞阳虚证＞阴虚证；CKD5期依次为：气虚证＞血虚证＞阳虚证＞阴虚证；气虚证在CKD各期分布均衡(P＞0.05)，血虚证、阴虚证和阳虚证在CKD各期分布不均衡(P＜0.05)。实性证候要素：CKD3期依次为：血瘀证＞湿热证＞水湿证＞湿浊证；CKD4期依次为：血瘀证＞湿热证＞湿浊证＞水湿证；CKD5期依次为：血瘀证＞湿热证＞湿浊证＞水湿证。血瘀证、湿热证、水湿证在CKD各期分布均衡(P＞0.05)；湿浊证在CKD各期分布不均衡(P＜0.05)。中医证候要素与实验室指标的关系，血红蛋白、血清白蛋白、血肌酐指标在虚性证候要素之间的差异有统计学意义(P＜0.05)，24h尿蛋白定量差异无统计学意义(P＞0.05)。血虚证、阳虚证患者血红蛋白水平明显低于气虚证、阴虚证患者(P＜0.05)；气虚证患者白蛋白水平明显低于血虚证、阴虚证、阳虚证患者(P＜0.05)；血虚证和阳虚证患者血肌酐明显高于气虚证、阴虚证患者(P＜0.05)。血红蛋白、血清白蛋白、血肌酐、24h尿蛋白定量在实性证候要素之间的差异均无统计学意义(P＞0.05)。
2.毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA及其配伍对缺血损伤HRGEC的保护作用：毛蕊异黄酮的最佳作用浓度为10mg/L，丹参酮ⅡA的最佳作用浓度为0.05mg/L，毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍的最佳作用浓度为10mg/L+0.025mg/L；Earles平衡盐诱导的HRGEC缺血损伤使存活率降低，凋亡率升高，粘附能力降低，细胞内活性氧水平升高(P＜0.05)；毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA可提高HRGEC存活率，减少凋亡，降低细胞内活性氧水平(P＜0.05)，两药配伍优于单药(P＜0.05)，丹参酮ⅡA可提高粘附能力(P＜0.05)，毛蕊异黄酮对粘附能力无改善(P＞0.05)。
3.毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍干预缺血损伤HRGEC血管生成的研究：Earles平衡盐诱导的缺血损伤使HRGEC迁移能力降低，成血管能力降低(P＜0.05)，毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍可改善缺血损伤引起的HRGEC迁移能力和成血管能力抑制(P＜0.05)；Earles平衡盐诱导的缺血损伤显著抑制了HRGEC线粒体呼吸能力，可降低基础呼吸、ATP产生能力和呼吸储备，毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍可显著改善缺血损伤HRGEC的线粒体呼吸能力，可提高基础呼吸、ATP产生能力和呼吸储备；毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对缺血损伤HRGEC基因表达谱的影响：模型组与正常组比较，共筛选出差异mRNA3464个，其中2273个上调，1191个下调(q-value≤0.05)；毛蕊异黄酮+丹参酮ⅡA配伍组与模型组比较，共筛选出差异mRNA642个，其中299个上调，343个下调(q-value≤0.05)；选取相关基因进行验证，q-RT-PCR检测SGK1、TP53、MAPK14、SLC2A3、VEGFA、CSmRNA表达，WesternBlot检测VEGFA、CS蛋白表达，验证结果显示各基因表达变化同测序结果趋势基本相同，提示测序结果真实可靠。
4.毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对SGK1/TP53/SLC2A3信号通路的调节作用：Earles平衡盐诱导的HRGEC缺血损伤引起SGK1、SLC2A3蛋白表达显著下调，TP53蛋白表达显著上调(P＜0.05)；毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍干预后SGK1、SLC2A3蛋白表达显著上调，TP53蛋白表达显著下调(P＜0.05)。采用EMD638683抑制SGK1表达后，SGK1、SLC2A3蛋白表达进一步显著下调，TP53蛋白表达进一步显著上调4.毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对SGK1/TP53/SLC2A3信号通路的调节作用：Earles平衡盐诱导的HRGEC缺血损伤引起SGK1、SLC2A3蛋白表达显著下调，TP53蛋白表达显著上调(P＜0.05)；毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍干预后SGK1、SLC2A3蛋白表达显著上调，TP53蛋白表达显著下调(P＜0.05)。采用EMD638683抑制SGK1表达后，SGK1、SLC2A3蛋白表达进一步显著下调，TP53蛋白表达进一步显著上调(P＜0.05)。
结论：临床研究：CKD病机虚实夹杂，气虚证、血瘀证在CKD各期普遍存在，气虚血瘀是CKD的基本病机；血虚证和阳虚证与血红蛋白、血肌酐有一定相关性，气虚证与血清白蛋白有一定相关性。实验研究：毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA对Earles平衡盐诱导的HRGEC缺血损伤具有显著保护作用，可提高细胞存活率，减少凋亡，降低细胞内活性氧水平，两药配伍优于单药，丹参酮ⅡA可提高细胞粘附能力。毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍具有显著促血管生成作用，可提高缺血损伤HRGEC迁移能力和成血管能力，其作用机制可能与调控CS、VEGFA、SGK1、TP53、SLC2A3表达，促进细胞存活，抑制凋亡，增强线粒体呼吸和葡萄糖代谢有关。