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目的:临床研究:收集CKD3~5期非透析患者的临床资料,综合分析CKD患者中医证候要素分布规律及其与疾病分期和实验室指标的关系,探讨CKD的基本病机和证候特征,为临床辨证论治提供客观依据。实验研究:探讨补气活血中药黄芪-丹参有效单体(毛蕊异黄酮-丹参酮ⅡA)对体外缺血损伤肾小球内皮细胞血管生成的影响及调节机制,为中医药采用补气活血法治疗肾脏疾病提供理论依据。
方法:
1.制定CKD患者中医证素调查表,纳入山东省中医院肾病科2016年12月至2018年10月的CKD3~5期非透析住院患者,采集患者一般资料、现病史、疾病分期、四诊信息和主要实验室指标等,使用SPSS22.0软件对患者基本资料、证素分布等进行统计分析,明确CKD常见中医证候要素分布规律及其与疾病分期和实验室指标的关系,探讨CKD的基本病机和证候特征。
2.毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA及其配伍对缺血损伤HRGEC的保护作用:体外培养人肾小球内皮细胞(HRGEC),以Earles平衡盐代替正常培养基诱导建立HRGEC缺血模型,采用MTT法筛选毛蕊异黄酮(0.1mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L)和丹参酮ⅡA(0.001mg/L、0.01mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L、1mg/L、10mg/L)保护Earles平衡盐诱导的缺血损伤HRGEC的最佳药物浓度,根据筛选出的最佳作用浓度,两药分设低、中、高3个剂量组,设计正交实验,采用MTT法筛选出两药最佳药物配伍比例;使用最佳作用浓度的毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA及其配伍干预Earles平衡诱导的HRGEC缺血模型,采用MTT实验、凋亡实验、粘附实验、活性氧检测实验观察毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA及其配伍对HRGEC存活率、凋亡、粘附能力、活性氧的影响。
3.毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍干预缺血损伤HRGEC血管生成的研究:采用细胞迁移实验、Matrigel血管生成实验观察毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对体外缺血损伤HRGEC血管生成的影响;采用SeahorseXF细胞能量代谢分析仪观察毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对缺血损伤HRGEC线粒体呼吸功能的影响;采用转录组测序技术检测毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA对缺血损伤HRGECmRNA表达谱的影响,筛选差异基因,使用q-RT-PCR和WesternBlot验证选取的差异基因表达情况。
4.毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对SGK1/TP53/SLC2A3信号通路的调节作用:SGK1抑制剂(EMD638683)抑制HRGECSGK1表达,Western-blot法检测SGK1、TP53、SLC2A3蛋白表达变化。
结果:
1.共纳入185例CKD3~5期非透析患者,男性104例,女性81例,男女比例为1.28:1。年龄介于25岁至92岁之间,平均年龄54.68±14.18岁。原发病中,以慢性肾小球肾炎为主,占36.76%,其次为糖尿病肾病,占22.70%。合并症及并发症中,高血压最为多见,共162例,占87.57%,其次为贫血96例,占51.89%。中医症状频率出现大于20%的依次为倦怠乏力、面色黧黑或晦暗、水肿、肢体困重、面色无华或萎黄、唇甲色淡、食少纳呆、大便溏软、少气懒言、小便清长或夜尿多、脘腹胀满、口干口苦、畏寒肢冷、面色晄白、口咽干燥、恶心呕吐、肢体麻木,活动不灵、便结而尿短赤。中医证候要素构成,以虚实夹杂证最为多见,共149例,占总例数的80.54%,单纯虚证仅占11.89%,单纯实证仅占7.57%;四种虚性证候要素中气虚证最为多见,共123例,占总例数的66.49%,血虚证次之,占45.95%,阳虚证占31.89%,阴虚证最少,占25.41%;四种实性证候要素中血瘀证最为多见,共102例,占总例数的55.14%,湿热证次之,占45.41%,湿浊证占17.84%,水湿证最少,占14.05%;虚实夹杂证候要素中,出现频率前十位的证候要素组合依次为气虚证+血瘀证+湿热证、气虚证+血瘀证、气虚证+血虚证+湿热证、气虚证+湿热证、气虚证+血瘀证+湿浊证、气虚证+血虚证+血瘀证+湿浊证、血虚证+湿热证、气虚证+血瘀证+水湿证、气虚证+阳虚证+血瘀证+水湿证、气虚证+血虚证+血瘀证+湿热证。不同分期CKD患者的证候要素频率分布情况,虚性证候要素:CKD3期依次为:气虚证>阴虚证>血虚证>阳虚证;CKD4期依次为:气虚证>血虚证>阳虚证>阴虚证;CKD5期依次为:气虚证>血虚证>阳虚证>阴虚证;气虚证在CKD各期分布均衡(P>0.05),血虚证、阴虚证和阳虚证在CKD各期分布不均衡(P<0.05)。实性证候要素:CKD3期依次为:血瘀证>湿热证>水湿证>湿浊证;CKD4期依次为:血瘀证>湿热证>湿浊证>水湿证;CKD5期依次为:血瘀证>湿热证>湿浊证>水湿证。血瘀证、湿热证、水湿证在CKD各期分布均衡(P>0.05);湿浊证在CKD各期分布不均衡(P<0.05)。中医证候要素与实验室指标的关系,血红蛋白、血清白蛋白、血肌酐指标在虚性证候要素之间的差异有统计学意义(P<0.05),24h尿蛋白定量差异无统计学意义(P>0.05)。血虚证、阳虚证患者血红蛋白水平明显低于气虚证、阴虚证患者(P<0.05);气虚证患者白蛋白水平明显低于血虚证、阴虚证、阳虚证患者(P<0.05);血虚证和阳虚证患者血肌酐明显高于气虚证、阴虚证患者(P<0.05)。血红蛋白、血清白蛋白、血肌酐、24h尿蛋白定量在实性证候要素之间的差异均无统计学意义(P>0.05)。
2.毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA及其配伍对缺血损伤HRGEC的保护作用:毛蕊异黄酮的最佳作用浓度为10mg/L,丹参酮ⅡA的最佳作用浓度为0.05mg/L,毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍的最佳作用浓度为10mg/L+0.025mg/L;Earles平衡盐诱导的HRGEC缺血损伤使存活率降低,凋亡率升高,粘附能力降低,细胞内活性氧水平升高(P<0.05);毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA可提高HRGEC存活率,减少凋亡,降低细胞内活性氧水平(P<0.05),两药配伍优于单药(P<0.05),丹参酮ⅡA可提高粘附能力(P<0.05),毛蕊异黄酮对粘附能力无改善(P>0.05)。
3.毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍干预缺血损伤HRGEC血管生成的研究:Earles平衡盐诱导的缺血损伤使HRGEC迁移能力降低,成血管能力降低(P<0.05),毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍可改善缺血损伤引起的HRGEC迁移能力和成血管能力抑制(P<0.05);Earles平衡盐诱导的缺血损伤显著抑制了HRGEC线粒体呼吸能力,可降低基础呼吸、ATP产生能力和呼吸储备,毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍可显著改善缺血损伤HRGEC的线粒体呼吸能力,可提高基础呼吸、ATP产生能力和呼吸储备;毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对缺血损伤HRGEC基因表达谱的影响:模型组与正常组比较,共筛选出差异mRNA3464个,其中2273个上调,1191个下调(q-value≤0.05);毛蕊异黄酮+丹参酮ⅡA配伍组与模型组比较,共筛选出差异mRNA642个,其中299个上调,343个下调(q-value≤0.05);选取相关基因进行验证,q-RT-PCR检测SGK1、TP53、MAPK14、SLC2A3、VEGFA、CSmRNA表达,WesternBlot检测VEGFA、CS蛋白表达,验证结果显示各基因表达变化同测序结果趋势基本相同,提示测序结果真实可靠。
4.毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对SGK1/TP53/SLC2A3信号通路的调节作用:Earles平衡盐诱导的HRGEC缺血损伤引起SGK1、SLC2A3蛋白表达显著下调,TP53蛋白表达显著上调(P<0.05);毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍干预后SGK1、SLC2A3蛋白表达显著上调,TP53蛋白表达显著下调(P<0.05)。采用EMD638683抑制SGK1表达后,SGK1、SLC2A3蛋白表达进一步显著下调,TP53蛋白表达进一步显著上调4.毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对SGK1/TP53/SLC2A3信号通路的调节作用:Earles平衡盐诱导的HRGEC缺血损伤引起SGK1、SLC2A3蛋白表达显著下调,TP53蛋白表达显著上调(P<0.05);毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍干预后SGK1、SLC2A3蛋白表达显著上调,TP53蛋白表达显著下调(P<0.05)。采用EMD638683抑制SGK1表达后,SGK1、SLC2A3蛋白表达进一步显著下调,TP53蛋白表达进一步显著上调(P<0.05)。
结论:临床研究:CKD病机虚实夹杂,气虚证、血瘀证在CKD各期普遍存在,气虚血瘀是CKD的基本病机;血虚证和阳虚证与血红蛋白、血肌酐有一定相关性,气虚证与血清白蛋白有一定相关性。实验研究:毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA对Earles平衡盐诱导的HRGEC缺血损伤具有显著保护作用,可提高细胞存活率,减少凋亡,降低细胞内活性氧水平,两药配伍优于单药,丹参酮ⅡA可提高细胞粘附能力。毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍具有显著促血管生成作用,可提高缺血损伤HRGEC迁移能力和成血管能力,其作用机制可能与调控CS、VEGFA、SGK1、TP53、SLC2A3表达,促进细胞存活,抑制凋亡,增强线粒体呼吸和葡萄糖代谢有关。
方法:
1.制定CKD患者中医证素调查表,纳入山东省中医院肾病科2016年12月至2018年10月的CKD3~5期非透析住院患者,采集患者一般资料、现病史、疾病分期、四诊信息和主要实验室指标等,使用SPSS22.0软件对患者基本资料、证素分布等进行统计分析,明确CKD常见中医证候要素分布规律及其与疾病分期和实验室指标的关系,探讨CKD的基本病机和证候特征。
2.毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA及其配伍对缺血损伤HRGEC的保护作用:体外培养人肾小球内皮细胞(HRGEC),以Earles平衡盐代替正常培养基诱导建立HRGEC缺血模型,采用MTT法筛选毛蕊异黄酮(0.1mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L)和丹参酮ⅡA(0.001mg/L、0.01mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L、1mg/L、10mg/L)保护Earles平衡盐诱导的缺血损伤HRGEC的最佳药物浓度,根据筛选出的最佳作用浓度,两药分设低、中、高3个剂量组,设计正交实验,采用MTT法筛选出两药最佳药物配伍比例;使用最佳作用浓度的毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA及其配伍干预Earles平衡诱导的HRGEC缺血模型,采用MTT实验、凋亡实验、粘附实验、活性氧检测实验观察毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA及其配伍对HRGEC存活率、凋亡、粘附能力、活性氧的影响。
3.毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍干预缺血损伤HRGEC血管生成的研究:采用细胞迁移实验、Matrigel血管生成实验观察毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对体外缺血损伤HRGEC血管生成的影响;采用SeahorseXF细胞能量代谢分析仪观察毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对缺血损伤HRGEC线粒体呼吸功能的影响;采用转录组测序技术检测毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA对缺血损伤HRGECmRNA表达谱的影响,筛选差异基因,使用q-RT-PCR和WesternBlot验证选取的差异基因表达情况。
4.毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对SGK1/TP53/SLC2A3信号通路的调节作用:SGK1抑制剂(EMD638683)抑制HRGECSGK1表达,Western-blot法检测SGK1、TP53、SLC2A3蛋白表达变化。
结果:
1.共纳入185例CKD3~5期非透析患者,男性104例,女性81例,男女比例为1.28:1。年龄介于25岁至92岁之间,平均年龄54.68±14.18岁。原发病中,以慢性肾小球肾炎为主,占36.76%,其次为糖尿病肾病,占22.70%。合并症及并发症中,高血压最为多见,共162例,占87.57%,其次为贫血96例,占51.89%。中医症状频率出现大于20%的依次为倦怠乏力、面色黧黑或晦暗、水肿、肢体困重、面色无华或萎黄、唇甲色淡、食少纳呆、大便溏软、少气懒言、小便清长或夜尿多、脘腹胀满、口干口苦、畏寒肢冷、面色晄白、口咽干燥、恶心呕吐、肢体麻木,活动不灵、便结而尿短赤。中医证候要素构成,以虚实夹杂证最为多见,共149例,占总例数的80.54%,单纯虚证仅占11.89%,单纯实证仅占7.57%;四种虚性证候要素中气虚证最为多见,共123例,占总例数的66.49%,血虚证次之,占45.95%,阳虚证占31.89%,阴虚证最少,占25.41%;四种实性证候要素中血瘀证最为多见,共102例,占总例数的55.14%,湿热证次之,占45.41%,湿浊证占17.84%,水湿证最少,占14.05%;虚实夹杂证候要素中,出现频率前十位的证候要素组合依次为气虚证+血瘀证+湿热证、气虚证+血瘀证、气虚证+血虚证+湿热证、气虚证+湿热证、气虚证+血瘀证+湿浊证、气虚证+血虚证+血瘀证+湿浊证、血虚证+湿热证、气虚证+血瘀证+水湿证、气虚证+阳虚证+血瘀证+水湿证、气虚证+血虚证+血瘀证+湿热证。不同分期CKD患者的证候要素频率分布情况,虚性证候要素:CKD3期依次为:气虚证>阴虚证>血虚证>阳虚证;CKD4期依次为:气虚证>血虚证>阳虚证>阴虚证;CKD5期依次为:气虚证>血虚证>阳虚证>阴虚证;气虚证在CKD各期分布均衡(P>0.05),血虚证、阴虚证和阳虚证在CKD各期分布不均衡(P<0.05)。实性证候要素:CKD3期依次为:血瘀证>湿热证>水湿证>湿浊证;CKD4期依次为:血瘀证>湿热证>湿浊证>水湿证;CKD5期依次为:血瘀证>湿热证>湿浊证>水湿证。血瘀证、湿热证、水湿证在CKD各期分布均衡(P>0.05);湿浊证在CKD各期分布不均衡(P<0.05)。中医证候要素与实验室指标的关系,血红蛋白、血清白蛋白、血肌酐指标在虚性证候要素之间的差异有统计学意义(P<0.05),24h尿蛋白定量差异无统计学意义(P>0.05)。血虚证、阳虚证患者血红蛋白水平明显低于气虚证、阴虚证患者(P<0.05);气虚证患者白蛋白水平明显低于血虚证、阴虚证、阳虚证患者(P<0.05);血虚证和阳虚证患者血肌酐明显高于气虚证、阴虚证患者(P<0.05)。血红蛋白、血清白蛋白、血肌酐、24h尿蛋白定量在实性证候要素之间的差异均无统计学意义(P>0.05)。
2.毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA及其配伍对缺血损伤HRGEC的保护作用:毛蕊异黄酮的最佳作用浓度为10mg/L,丹参酮ⅡA的最佳作用浓度为0.05mg/L,毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍的最佳作用浓度为10mg/L+0.025mg/L;Earles平衡盐诱导的HRGEC缺血损伤使存活率降低,凋亡率升高,粘附能力降低,细胞内活性氧水平升高(P<0.05);毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA可提高HRGEC存活率,减少凋亡,降低细胞内活性氧水平(P<0.05),两药配伍优于单药(P<0.05),丹参酮ⅡA可提高粘附能力(P<0.05),毛蕊异黄酮对粘附能力无改善(P>0.05)。
3.毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍干预缺血损伤HRGEC血管生成的研究:Earles平衡盐诱导的缺血损伤使HRGEC迁移能力降低,成血管能力降低(P<0.05),毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍可改善缺血损伤引起的HRGEC迁移能力和成血管能力抑制(P<0.05);Earles平衡盐诱导的缺血损伤显著抑制了HRGEC线粒体呼吸能力,可降低基础呼吸、ATP产生能力和呼吸储备,毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍可显著改善缺血损伤HRGEC的线粒体呼吸能力,可提高基础呼吸、ATP产生能力和呼吸储备;毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对缺血损伤HRGEC基因表达谱的影响:模型组与正常组比较,共筛选出差异mRNA3464个,其中2273个上调,1191个下调(q-value≤0.05);毛蕊异黄酮+丹参酮ⅡA配伍组与模型组比较,共筛选出差异mRNA642个,其中299个上调,343个下调(q-value≤0.05);选取相关基因进行验证,q-RT-PCR检测SGK1、TP53、MAPK14、SLC2A3、VEGFA、CSmRNA表达,WesternBlot检测VEGFA、CS蛋白表达,验证结果显示各基因表达变化同测序结果趋势基本相同,提示测序结果真实可靠。
4.毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对SGK1/TP53/SLC2A3信号通路的调节作用:Earles平衡盐诱导的HRGEC缺血损伤引起SGK1、SLC2A3蛋白表达显著下调,TP53蛋白表达显著上调(P<0.05);毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍干预后SGK1、SLC2A3蛋白表达显著上调,TP53蛋白表达显著下调(P<0.05)。采用EMD638683抑制SGK1表达后,SGK1、SLC2A3蛋白表达进一步显著下调,TP53蛋白表达进一步显著上调4.毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对SGK1/TP53/SLC2A3信号通路的调节作用:Earles平衡盐诱导的HRGEC缺血损伤引起SGK1、SLC2A3蛋白表达显著下调,TP53蛋白表达显著上调(P<0.05);毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍干预后SGK1、SLC2A3蛋白表达显著上调,TP53蛋白表达显著下调(P<0.05)。采用EMD638683抑制SGK1表达后,SGK1、SLC2A3蛋白表达进一步显著下调,TP53蛋白表达进一步显著上调(P<0.05)。
结论:临床研究:CKD病机虚实夹杂,气虚证、血瘀证在CKD各期普遍存在,气虚血瘀是CKD的基本病机;血虚证和阳虚证与血红蛋白、血肌酐有一定相关性,气虚证与血清白蛋白有一定相关性。实验研究:毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA对Earles平衡盐诱导的HRGEC缺血损伤具有显著保护作用,可提高细胞存活率,减少凋亡,降低细胞内活性氧水平,两药配伍优于单药,丹参酮ⅡA可提高细胞粘附能力。毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍具有显著促血管生成作用,可提高缺血损伤HRGEC迁移能力和成血管能力,其作用机制可能与调控CS、VEGFA、SGK1、TP53、SLC2A3表达,促进细胞存活,抑制凋亡,增强线粒体呼吸和葡萄糖代谢有关。