研究背景:　　乳腺癌是常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着妇女的生命和健康。最新研究表明，肿瘤的发生与细胞自噬和细胞凋亡密切相关。自噬基因Beclin-1是酵母菌Atg6/Vps-30的同源基因，Beclin-1参与自噬体形成，并与肿瘤的形成、胚胎发育和疾病的发生密切相关。Bcl-2是一种原癌基因，与细胞凋亡存在密切关系。Bcl-2翻译的蛋白可抑制细胞凋亡进而促进肿瘤生长，通过封闭Bcl-2mRNA功能区，降低Bcl-2蛋白表达，可抑制肿瘤细胞的生长。Caspase是一组半胱氨酸蛋白酶家族，在细胞凋亡过程中起着关键性的作用。Caspase-9属于凋亡启动组成员，是Caspase家族引起细胞凋亡最重要的启动因子。通常情况下，Caspase-9以无活性的酶原形式存在，当受到凋亡信号刺激后，可发生自我激化并次序激活下游的Caspase因子，然后引起级联放大效应，导致细胞功能丧失或结构改变，引起细胞凋亡。　　小檗碱亦称为黄连素，是黄连中主要的异喹啉生物碱。在临床上，小檗碱长期被用于解热、解毒、抗胃肠道细菌感染。近年来，研究人员发现小檗碱还有抗心律失常、降血脂、降血压、抗消化性溃疡和抗肿瘤等药理作用。小檗碱对于多种肿瘤细胞如人白血病细胞、肝癌细胞、胃癌细胞等的生长具有明显抑制作用。但目前关于小檗碱对乳腺癌细胞增殖及凋亡的影响，可能的作用机制方面的研究却较少报道。　　研究目的：　　分组培养乳腺癌MCF-7细胞（3个小檗碱浓度组10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml）和对照组，探讨小檗碱对乳腺癌MCF-7细胞凋亡和增殖的效应，并对Beclin-1、bcl-2、Caspase-9在细胞凋亡中的作用机制进行初步探讨。　　材料与方法:　　1.细胞株:人乳腺癌MCF-7细胞株由河南省肿瘤医院中心实验室提供，用含10％胎牛血清，于37℃、5％二氧化碳(CO2)饱和湿度条件下培养。　　2.主要仪器和试剂:全自动酶标读数仪、流式细胞仪、倒置显微镜、医用低速离心机、CO2培养箱、盐酸小檗碱、Bcl-2试剂盒、FIX/perm Buffer试剂盒、FITC anti-Bcl-2、PE anti-Beclin-1、Caspase-9 ELISA试剂盒、CCK8试剂盒等。　　3.应用流式细胞仪和AnnexinⅤ/PI Assay试剂盒分别检测小檗碱处理各组乳腺癌MCF-7细胞后的细胞凋亡情况，FITC-AnnexinⅤ阳性、PI阴性的细胞群为凋亡细胞，计算凋亡细胞所占百分比，并以此代表乳腺癌细胞凋亡情况。　　4.应用PE anti-Beclin-1试剂盒检测小檗碱处理各组乳腺癌MCF-7细胞后Beclin-1蛋白表达情况，采用流式细胞仪检测Beclin-1阳性的乳腺癌MCF-7细胞所占百分比，并以此百分比代表Beclin-1活性。　　5.采用流式细胞仪和FITC anti-Bcl-2试剂盒检测Bcl-2阳性的各组乳腺癌MCF-7细胞所占百分比，并以此百分比代表Bcl-2活性。　　6.应用Caspase-9 ELISA试剂盒检测小檗碱处理各组乳腺癌MCF-7细胞后Caspase-9活性，分别将6个标准品OD值减去空白孔OD值，以6个标准品的OD值为纵坐标y，以标准品的浓度为横坐标x，绘制曲线图，计算线性回归方程，然后将待测样品的OD值代入方程式，计算各组样品浓度即为样品的Caspase-9实际浓度;应用CCK8试剂盒检测小檗碱处理乳腺癌MCF-7细胞后细胞增殖情况。　　7.统计分析:应用SAS9.1.3统计软件进行数据处理。定量变量用均数±标准差(Mean±SD)表示，不同时点、不同药物浓度处理组比较采用重复测量方差分析进行处理，P＜0.05表示差异具有统计学意义。　　结果：　　1.乳腺癌MCF-7细胞呈多边形和不规则形，贴壁生长，繁殖速度快，细胞死亡后呈圆形。不同浓度小檗碱处理乳腺癌MCF-7细胞后，随着小檗碱浓度的增加和时间的推移，乳腺癌MCF-7细胞死亡的数量增加，有明显的杀伤作用。　　2.应用流式细胞仪检测盐酸小檗碱处理乳腺癌MCF-7细胞后的凋亡情况。12小时后，10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml小檗碱处理组细胞凋亡细胞百分比的平均值分别为10.29％、13.39％和15.12％;处理24小时后，三个浓度组凋亡细胞百分比的平均值分别为10.51％、12.59％和14.32％;处理48小时后，三个浓度组凋亡细胞百分比的平均值分别为16.64％、20.06％和45.23％。盐酸小檗碱处理乳腺癌MCF-7细胞后，不同浓度盐酸小檗碱处理组的细胞凋亡百分比差异有统计学意义(F=568.58，P＜0.05)。不同时间点各组乳腺癌MCF-7细胞的凋亡百分比差异有统计学意义(F=129.53，P＜0.05)，同时不同浓度处理组和不同时间观察点的交互作用项亦具有统计学意义(F=325.25，P＜0.05)。随着小檗碱浓度增加，处理时间延长，乳腺癌MCF-7细胞发生凋亡的百分比逐渐升高。　　3.小檗碱作用于乳腺癌MCF-7细胞12小时后，对照组、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml处理组细胞Caspase-9蛋白含量平均值分别为34.25 IU/L、40.17IU/L、45.08 IU/L和48.80 IU/L;24小时后，对照组和三个浓度处理组细胞Caspase-9蛋白含量平均值分别为41.21 IU/L、43.26 IU/L、49.39 IU/L和51.79IU/L;48小时后，对照组和三个药物浓度组Caspase-9蛋白含量分别为52.38IU/L、55.96 IU/L、58.95 IU/L和69.73 IU/L。不同浓度小檗碱处理组细胞Caspase-9蛋白表达量之间的差异有统计学意义(F=76.73，P＜0.05)，不同时间点各组乳腺癌MCF-7细胞Caspase-9蛋白表达量的差异亦有统计学意义(F=114.94，P＜0.05)。盐酸小檗碱可诱导乳腺癌MCF-7细胞Caspase-9蛋白酶表达和活性，并具有时间或浓度依赖性。　　4.应用FITC anti-Bcl-2试剂盒检测小檗碱对乳腺癌MCF-7细胞Bcl-2活性的影响，小檗碱处理乳腺癌MCF-7细胞12小时后，对照组、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml组Bcl-2阳性细胞百分比平均值分别为17.34％、14.03％、11.64％和7.97％;24小时后，对照组和三个浓度组Bcl-2阳性细胞百分比平均值分别为10.21％、8.70％、7.49％、6.28％;48小时后，对照组和三个浓度组Bcl-2阳性细胞百分比平均值分别为10.14％，6.78％、5.77％、4.64％。乳腺癌MCF-7细胞Bcl-2活性随着小檗碱浓度的升高呈下降趋势。与处理12小时组相比，小檗碱处理乳腺癌MCF-7细胞24小时和48小时后，3个浓度组细胞Bcl-2活性均明显下降。采用PE anti-Beclin-1试剂盒检测小檗碱对乳腺癌MCF-7细胞Beclin-1活性的影响，流式细胞仪检测结果显示，随着盐酸小檗碱处理浓度的升高，处理时间的延长，乳腺癌MCF-7细胞Beclin-1表达量及活性明显升高。　　5.应用CCK8试剂盒检测小檗碱对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响，12小时后，对照组、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml浓度组细胞增殖OD值的平均值分别为1.08、1.06、1.04、0.98;48小时后，对照组和三个浓度组细胞增殖OD值的平均值分别为2.91、1.18、0.87和0.34。盐酸小檗碱处理乳腺癌MCF-7细胞后，乳腺癌MCF-7细胞增殖活性（OD值）随小檗碱浓度的升高呈下降趋势，不同浓度盐酸小檗碱处理组的细胞增殖活性之间的差异有统计学意义(P＜0.05);与12小时相比，盐酸小檗碱处理48小时后，3个浓度组细胞增殖活性明显降低，不同时间点各组乳腺癌MCF-7细胞增殖活性的差异有统计学意义(P＜0.05)小檗碱明显降低乳腺癌MCF-7细胞的增殖活性。　　结论：　　1.小檗碱可明显抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖，并诱导其凋亡;　　2.小檗碱可能通过激活Caspase-9，抑制Bcl-2表达和活性，并增加Beclin-1表达和活性，进而诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡。