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目的: 角膜无血管化状态维持着角膜的免疫赦免和透明性,眼外伤、感染、角膜移植等可引起角膜新生血管,影响视力甚至致盲,角膜新生血管也是引起角膜移植免疫排斥发生的重要原因。针对角膜新生血管发生过程中的炎症和血管内皮细胞变化,发展了诸多抑制角膜新生血管的药物及方法,如糖皮质激素、FK506、抗VEGF等。常规缝线诱导角膜新生血管模型中存在角膜张应力的变化,张应力变化会诱导角膜中VEGF水平的升高,从而诱导角膜新生血管,但对于张应力如何调控角膜VEGF表达,进而影响角膜新生血管的机制还不明确。 本研究拟检测已知的microRNAs在缝线和碱烧伤诱导的两种小鼠角膜新生血管模型中的表达变化,筛选出变化最为明显的microRNA;通过缝线诱导的小鼠角膜新生血管模型,检测该microRNA的表达定位,及其对新生血管形成的影响和机制;进一步通过体外培养人角膜上皮细胞和微血管内皮细胞,观察张应力变化对该microRNA表达及其对微血管内皮细胞的影响。 方法: 1. 碱烧伤和缝线诱导的角膜新生血管中microRNAs的表达变化 选择成年6~8周龄BALB/c小鼠为实验动物,碱烧伤模型采用浸润1N氢氧化钠的滤纸(直径2mm)置于角膜中央,作用40秒后,立即以生理盐水冲洗40秒,眼表涂氧氟沙星眼膏;缝线模型采用11-0线在角膜旁中央区板层放射状缝合2针;术后10天取角膜,RT-PCR检测角膜中miR-10a、16、24、101a、126b、184、200b、204的表达情况。 2. 角膜新生血管中miR-204的表达变化和定位 建立小鼠角膜缝线模型,术后通过裂隙灯观察新生血管生长情况,术后10天拆除缝线,观察至20天取角膜;RT-PCR分别检测角膜上皮和基质中miR-204的表达情况。取人正常角膜和人新生血管化的病变角膜,RT-PCR检测角膜上皮中miR-204的表达情况。 取人正常角膜、人新生血管化的病变角膜、正常小鼠角膜和新生血管化小鼠角膜,用原位杂交法检测miR-204在角膜中的表达位置。 3. MiR-204对角膜新生血管的影响 建立角膜缝线模型,将角膜缝线小鼠随机分为: (1)PBS组:结膜下注射PBS; (2)NTC组:结膜下注射NTC(agomir negative control); (3)miR-204 agomir组:分别在缝线0天、3天、6天结膜下注射。 术后3天、5天、7天、10天裂隙灯显微镜观察,术后10天取角膜;CD31标记角膜新生血管,角膜铺片统计并比较角膜新生血管面积;免疫组织化学和Western blot检测VEGF-A、VEGF-C、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3的表达变化。 4. MiR-204对人角膜上皮细胞VEGF-A表达的影响 体外培养人原代角膜上皮细胞,分为: (1)正常对照组; (2)加力+NTC组; (3)加力+miR-204 agomir组; 以Flexcell加力装置对细胞进行张应力作用(拉伸度5%,频率为1Hz,6小时),收取细胞,RT-PCR检测miR-204及VEGF-A的表达变化, Western blot检测VEGF-A蛋白水平的变化。 5. MiR-204对人微血管内皮细胞增殖、迁移及成管能力的影响 体外培养人微血管内皮细胞,分为: (1)正常对照组; (2)NTC组; (3)miR-204 agomir组; 培养基中加NTC或miR-204 agomir处理后,CCK8法检测细胞增殖力、划痕法比较细胞迁移面积以及统计成管能力。 结果: 1. 角膜新生血管中microRNAs的表达变化 在缝线诱导的角膜新生血管模型中,术后第3天角膜缘即出现新生血管芽,到第10天时角膜水肿,血管生长旺盛,到达缝线位置甚至超越缝线;10天RT-PCR检测发现:miR-16、24、126b、184、200b、204低表达,miR-10a、101a表达无明显变化。 在碱烧伤诱导的角膜新生血管模型中,术后2~3天角膜缘出现新生血管,10天取角膜RT-PCR检测,与正常角膜比较,新生血管化角膜中:miR-10a、16、24、184、204低表达,miR-126b、200b高表达,miR-101a表达无明显变化。 2. MiR-204在新生血管化角膜中的表达变化 角膜缝线10天时,角膜新生血管生长旺盛,RT-PCR检测到miR-204的表达水平明显低于正常角膜(p<0.05);而且,与角膜松缝线比较,角膜紧缝线诱发更多的新生血管生长、miR-204降低更明显。10天拆除角膜缝线,观察至20天血管明显消退,取角膜,RT-PCR检测miR-204表达明显高于10天时miR-204的表达(p<0.05);从而确定miR-204在抑制角膜新生血管方面发挥重要作用。 3. MiR-204主要表达在角膜上皮细胞 分别对人、小鼠的正常、带血管的角膜上皮和基质进行RT-PCR检测,结果显示, miR-204表达变化主要发生于角膜上皮细胞;采用原位杂交法进一步验证miR-204在角膜中的表达,发现其在正常角膜上皮中高表达,而发生角膜新生血管后,miR-204在上皮中的表达明显降低。因此证实,在正常角膜中,miR-204主要位于角膜的上皮细胞;在发生角膜新生血管时,miR-204的表达变化主要位于角膜上皮。 4. MiR-204抑制小鼠角膜新生血管 与PBS组和NTC组相比,结膜下注射miR-204 agomir后,角膜新生血管面积明显减少,VEGF-A和VEGFR2表达水平明显下降。说明miR-204通过降低VEGF-A和VEGFR2来发挥其抑制角膜新生血管的作用。同时,结膜下注射miR-204 agomir具有抑制角膜新生淋巴管的作用。 5. MiR-204对人角膜上皮细胞VEGF-A表达的影响 体外培养人原代角膜上皮细胞,在周期性张应力作用下,人角膜上皮细胞的miR-204表达明显降低,同时伴有VEGF-A表达升高;经过miR-204 agomir处理的细胞再用同样的张应力作用时,VEGF-A水平明显降低。说明miR-204有降低周期性张应力引起的细胞高表达VEGF-A的作用。 6. MiR-204抑制人微血管内皮细胞增殖、迁移及成管 MiR-204 agomir对人微血管内皮细胞的增殖能力有明显的抑制作用(p<0.05);与NTC处理的细胞相比较,miR-204 agomir处理的细胞的迁移面积降低了约30%(p<0.05);此外,成管实验中,经miR-204 agomir转染的人微血管内皮细胞成管数量(0.58±0.08)也明显少于对照(1.02±0.16)(p<0.05)。 结论: 1. 在缝线或碱烧伤诱导的角膜新生血管模型及人新生血管化角膜中,miR-204降低明显。 2. 角膜紧缝线更易诱发角膜新生血管,新生血管化的角膜miR-204表达低;角膜上皮源性的miR-204通过调控VEGF-A和VEGFR2的表达而发挥抑制角膜新生血管的作用;机械力调控miR-204的表达,miR-204通过降低VEGF-A和VEGFR2的表达而发挥抑制角膜新生血管的作用。 3. 周期性张应力刺激引起角膜上皮细胞miR-204表达水平下降,同时VEGF-A表达水平上升;外源性增强miR-204的表达能抑制周期性张应力引起的角膜上皮细胞高表达VEGF-A,并抑制人微血管内皮细胞的增殖、迁移及血管形成能力。 创新和意义 本课题首次证实在缝线诱导的小鼠角膜新生血管模型中,角膜上皮表达的miR-204具有抑制角膜新生血管的作用。体外实验证实缝线引起的周期性张应力可调控角膜上皮细胞miR-204的表达,外源性miR-204 agomir抑制VEGF-A和VEGFR2的表达,以及微血管内皮细胞的增殖、迁移和成管能力。本研究为更好的理解角膜新生血管的发生机制提供新的依据,为临床治疗角膜新生血管提供新的思路。