多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是女性最常见的内分泌紊乱性疾病，临床特征为持续无排卵、高雄激素血症以及超声下见卵巢呈多囊样改变，其发生糖尿病、高血压、心血管疾病及子宫内膜癌的风险增加。在闭经患者中约占30%，在月经稀少和排卵功能障碍性不孕患者中可高达90%。目前，该病机制仍不是很清楚。有研究认为卵泡生长发育异常可能是引起PCOS不排卵及临床内分泌改变的病理基础，而内在性的卵泡发育异常可能与卵巢颗粒细胞的凋亡调控失常有关。此外，卵巢颗粒细胞的增殖和凋亡与卵泡的发育成熟及闭锁密切相关，多种调控因子参与颗粒细胞增殖和凋亡的过程。再生基因Reg家族，属钙依赖性凝集素超家族(calcium-dependentlectin superfamily)，代表一组小分子、多功能的分泌性蛋白。1984年由法国人Keim首先在急性胰腺炎的大鼠胰液中发现，其功能相当于急性反应蛋白和胰腺β细胞、神经细胞以及消化系统上皮细胞等的抗凋亡因子或生长因子。根据Reg基因编码蛋白的一级结构，Reg家族可分为4个亚型：I、II、III和IV。主要参与组织损伤、炎症及糖尿病和肿瘤的发生。Reg IV基因作为Reg基因家族的新成员，由Hanupee等于2001年在研究炎症性肠病时首次分离筛选鉴定并报道。该基因定位于1号染色体(1q12-q21)，由17496个碱基对构成，包含6个外显子和5个内含子。其蛋白相对分子质量约17kDa。大量研究表明Reg IV参与细胞的增殖、凋亡、再生和炎性、化生反应，并与肿瘤的发生、发展密切相关。然而对于Reg IV的生物学功能的研究还不是很透彻，它是否在卵巢中表达并参与卵泡的发育以及颗粒细胞的凋亡和增殖等都未见任何报导。因此，本研究首先通过免疫组织化学染色、定量RT-PCR以及Western blot分析观察Reg IV在正常和PCOS模型大鼠卵巢的表达情况，以探讨Reg IV是否与PCOS的发病相关。此外，Reg IV触发的信号通路、靶点、与其它级联的交叉以及与其它因子的相互作用和影响仍不清楚，所以我们接着采用大鼠卵巢颗粒细胞体外培养的方法，研究外源性的Reg IV蛋白对颗粒细胞增殖与凋亡的影响，并应用小分子RNA干扰技术抑制Reg IV表达，进一步探讨Reg IV对EGFR/Akt及IGF-I/Akt信号通路及凋亡相关基因Bax和Bcl-2表达的影响。吴茱萸（Evodia rutaecarpa）为芸香科植物吴茱萸及其变种石虎和疏毛吴茱萸干燥的近成熟果实。其药理作用比较多：如镇痛、镇静、抗菌、降压、抗缺氧等。吴茱萸碱（Evodiamine，evo）作为其主要生物碱之一，具有多种药理学效应，如降低体重、抗炎、降低血糖，改善胰岛素抵抗、调节体温、抑制肿瘤生长、镇痛及对心血管和内分泌系统的作用。多囊卵巢综合征病因复杂，发病机制涉及内分泌、神经、代谢等诸多方面。PCOS患者中肥胖的比例超过50%，胰岛素抵抗发生率为50%-70%，占发病患者的绝大部分。长期以来，有关多囊卵巢综合征的治疗方案已有许多研究和改进，但是临床效果仍不够理想。而目前吴茱萸碱在妇科生殖内分泌领域的研究还很少，所以本课题还将初步探讨吴茱萸碱对多囊卵巢综合征模型大鼠的作用，并进一步研究其对PCOS模型大鼠卵巢Reg IV表达的影响及机制，以及Evo对体外培养的颗粒细胞中Reg IV作用的影响。这些将为开发新的治疗多囊卵巢综合征的药物和指导临床治疗提供新的策略，同时也为我们进一步研究多囊卵巢综合征发生发展机制奠定基础。本研究共分为如下四个部分：第一部分：Reg IV基因在正常大鼠生殖系统的表达及意义目的探讨Reg IV在大鼠卵巢和子宫中的表达情况。方法通过RT-PCR和Western blotting方法，分别从mRNA和蛋白水平来分析RegIV的表达。通过免疫组化染色分析Reg IV蛋白在大鼠卵巢和子宫中的表达定位。结果Reg IV在卵巢的表达显著高于其在子宫的表达。在大鼠卵巢的卵泡颗粒细胞、卵母细胞、黄体和间质细胞中观察到Reg IV的强染色信号，尤其在颗粒细胞中表达明显。在大鼠子宫中，仅仅在内膜腔上皮和腺上皮细胞中检测到弱的Reg IV染色信号。结论Reg IVmRNA和蛋白在正常大鼠生殖系统器官卵巢和子宫中均有表达，提示Reg IV可能在生殖系统细胞生长和增殖中具有潜在作用。第二部分：Reg IV基因在PCOS模型大鼠卵巢中的表达目的探讨Reg IV在PCOS模型大鼠卵巢组织中的表达情况。方法采用Poretsky法用INS联合HCG诱导SD大鼠建立PCOS模型，观察大鼠体重变化及卵巢相对重量；放免分析法测定血清T、LH、FSH、E2、INS水平；HE染色观察卵巢形态改变；免疫组织化学方法检测Reg IV及相关因子EGFR、IGF-I蛋白在卵巢组织的定位表达；定量RT-PCR和Western blotting分别检测Reg IV及相关因子EGFR、IGF-I在mRNA和蛋白水平的表达。结果Reg IV表达于大鼠卵巢颗粒细胞、卵泡膜细胞以及黄体等部位；EGFR明显表达于大鼠卵巢卵泡颗粒细胞、卵泡膜细胞、卵巢间质以及黄体颗粒细胞等；IGF-I在正常大鼠卵巢卵泡颗粒细胞、卵母细胞和黄体颗粒细胞有表达。PCOS模型组卵巢中Reg IV和IGF-I mRNA及蛋白表达均低于正常对照组（P<0.05），而EGFR mRNA及蛋白表达高于正常对照组（P<0.05）。结论Reg IV的表达下调可能与PCOS的发病有关，且与IGF-I、EGFR可能存在相互作用。第三部分：Reg IV对大鼠卵巢颗粒细胞的作用及机制目的探讨Reg IV对大鼠卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响及信号通路。方法采用大鼠卵巢颗粒细胞体外培养的方法，通过MTT法研究外源性的Reg IV蛋白对颗粒细胞增殖与凋亡的影响，并应用小分子RNA干扰技术抑制Reg IV表达，进一步运用Western blotting检测Reg IV对EGFR/Akt及IGF-I/Akt信号通路及凋亡相关基因Bax和Bcl-2表达的影响。结果不同浓度的Reg IV蛋白对颗粒细胞的增殖均有促进作用，并随时间的延长和浓度的增加而增强。100nM Reg IV-siRNA2在转染颗粒细胞48h后阻断Reg IV蛋白的表达最明显。用Reg IV蛋白作用卵巢颗粒细胞后，IGF-I、EGFR、pEGFR、pAkt及Bcl-2的表达增加；与此同时，Reg IV-siRNA转染后的颗粒细胞则表现相反，IGF-I、EGFR、pEGFR、pAkt及Bcl-2的表达明显减少，而Bax的表达则明显增加。结论Reg IV能够通过增加IGF-I、EGFR的表达激活Akt信号通路，引起下游Bcl-2表达增加进而促进颗粒细胞增殖；当阻断Reg IV的表达后，IGF-I、EGFR表达受到影响，活化Akt减少，引起下游Bcl-2表达减少和Bax表达增加，从而促进颗粒细胞凋亡增加。我们推测Reg IV蛋白可能是EGFR/Akt和IGF-I/Akt信号通路的潜在激活剂。第四部分：吴茱萸碱对PCOS模型大鼠及Reg IV作用的影响目的观察吴茱萸碱对PCOS大鼠及Reg IV在卵巢和颗粒细胞中功能的影响。方法选用Poretsky PCOS动物模型，观察大鼠的体重、动情周期、血清性激素、胰岛素水平以及病理组织学变化。通过定量RT-PCR和Western blotting方法，分别从mRNA和蛋白水平来分析RegIV、EGFR及IGF-I的表达变化。通过免疫组化染色分析Reg IV、EGFR及IGF-I蛋白在大鼠卵巢中的表达定位。此外，用MTT法检测Evo对颗粒细胞中Reg IV作用的影响。结果吴茱萸碱能降低PCOS模型大鼠的体重、维持其动情周期、降低血清T、LH和INS水平；卵巢卵泡壁颗粒细胞层数和黄体数量增加。PCOS模型组大鼠卵巢组织中Reg IV和IGF-I的mRNA和蛋白表达水平较正常对照组降低。与PCOS模型组相比，经过药物干预治疗处理，Evo低剂量组、二甲双胍组、Evo高剂量组中RegIV和IGF-I的表达水平逐渐提高。然而，PCOS组大鼠卵巢中EGFRmRNA和蛋白的表达水平较正常对照组明显增加。与PCOS模型组相比，Evo低剂量组、Evo高剂量组、二甲双胍组中EGFR的表达水平逐渐降低。将不同浓度的Evo与Reg IV蛋白共培养，随着Evo浓度的增加和培养时间的延长，对颗粒细胞增殖开始出现抑制。结论吴茱萸碱具有降低体重、降低血清T、LH和INS水平、改善多囊卵巢征象和胰岛素抵抗、恢复排卵的作用。吴茱萸碱对PCOS大鼠卵巢中Reg IV及EGFR、IGF-I的表达均有影响，对Reg IV的促增殖有抑制，所以Reg IV有可能是吴茱萸碱的作用靶点之一。