蚜虫莫氏黑粉菌发酵产甘露糖赤藓糖醇脂的代谢调控及其群体感应机理研究

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甘露糖赤藓糖醇脂(MELs)是一种重要的非离子型糖脂类生物表面活性剂,具有多种理化特性和生理学活性,在食品、生物医药等领域具有极大的应用价值。蚜虫莫氏黑粉菌是MELs的重要生产菌株,但其生产效率和产物纯化等问题一直制约着MELs的产业化应用。此外,蚜虫莫氏黑粉菌发酵生产MELs过程中存在典型的真菌二型态转变现象,即群体感应特征。近年来,有关蚜虫莫氏黑粉菌出现一定的安全风险研究报道,认为与其形态转变具有密切联系,从而导致利用蚜虫莫氏黑粉菌工业发酵生产MELs面临潜在的安全风险。基于此,对蚜虫莫氏黑粉菌合成MELs的发酵条件、产物分离纯化及群体感应现象进行了研究,取得的主要结果如下:1、对氮源、金属离子、碳源进行液体深层发酵研究,结果表明:硝酸钠和酵母提取粉复配最有利于MELs合成,且添加酵母提取粉合成的MELs具有较低临界胶束浓度。以大豆油等脂溶性碳源为底物可以大量合成MELs,但以葡萄糖等水溶性碳源为底物不能合成MELs。Mg2+能显著提高MELs产量,缺乏时仅合成MEL-A且产量明显降低,Ca2+在缺乏Mg2+时可以促进MELs合成,但作用效果不如Mg2+,Fe2+或Fe3+抑制MELs合成。荧光定量PCR结果发现缺乏Mg2+、添加Fe2+或Fe3+均引起MELs合成关键基因Pa GEMT1、Pa GMAC1、Pa GMMF1和Pa GMAT1表达水平显著下调。2.利用两种发酵培养模式,结合分批补料和重力分离等方法开展MELs的发酵生产策略探究,结果表明:搅拌式发酵罐更有利于保持发酵体系的稳定和均匀,起始大豆油浓度或MELs浓度积累过高均不利于菌体生长和MELs合成。发酵初期以葡萄糖为碳源和后期补加大豆油的流加方案能有效提高MELs产量,结合分批补料与在线重力分离MELs方法,可以显著地延长生产持续时间,提高油脂转化回收率达88.89%,MELs合成速率增至0.617 m L/h/L。3.借助制备型色谱系统快速分离纯化MELs,对比不同流动相体系并优化其洗脱条件,发现正己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇四元流动相体系可在7 min内完成一次分离,具有分离效果好、速度快、溶剂毒性低、成本小等特点。利用NMR和HPLC-MS联用鉴定分析手段,表明纯化出的MELs中主要成分为MEL-A。4.借助多种显微成像方法观察菌体形态并采用光密度法测定菌体生长研究蚜虫莫氏黑粉菌的群体感应现象,发现不同条件下菌体呈现出短杆酵母状和丝状态两种个体形态及生物被膜态、菌蹼态两种群体形态,不同形态对两性霉素B的抗性不同。基于群体感应物质研究,发现调节丝状态-短杆酵母态的群体感应物质具有耐热、易溶于水、难挥发、分子量小于500 Da等理化性质,利用HPLC-MS和SCI-Finder数据库进行解析,推测该菌的关键群体感应物质为多元醇类。5.基于比较转录组学手段对MELs合成和菌体形态转变两种表型进行研究发现,参与MELs合成相关差异表达基因在脂肪酸代谢过程、膜的组成等功能上显著富集,主要参与脂质代谢、碳水化合物代谢等通路;与形态转变相关的差异表达基因在脂肪酸代谢及催化过程、膜组成和过氧化物酶体组成等功能上显著富集,主要参与氨基酸代谢、过氧化物酶体等代谢通路。生物信息学分析发现两者共有基因在过氧化物酶体和氨基酸代谢通路上显著富集,其中过氧化物酶体相关基因Pa G_02988、Pa G_04133主要参与脂肪酸的β-氧化过程。RT-q PCR验证转录组学分析结果具有可靠性,表明过氧化物酶体中参与脂肪酸β-氧化的基因与MELs合成和菌体形态转变均具有密切关系。
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