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肾脏纤维化(renal interstitial fibrosis，RIF)是多种慢性肾脏疾病发展至终末期肾脏病的共同通路。本质上，肾纤维化是以细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的过度积聚和沉积为特征的过程，产生基质(matrix)的细胞活化是肾纤维化形成的关键。当损伤及炎症因素持续存在时，成纤维细胞(fibrosis)增殖并产生过量的细胞外基质。此外，肾小球系膜细胞(mesangial cell)和肾小管上皮细胞(renal tubularepithelial cell，RTEC)是主要的产生细胞外基质的细胞。肾纤维化早期，系膜细胞和纤维母细胞发生活化，肾纤维化晚期出现肾小管上皮细胞向间充质细胞转分化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)。有学者发现，RIF状态下的成纤维细胞约36％来源于肾小管上皮细胞。近年来，肾小管EMT在肾纤维化中的作用日益受到重视。从器官纤维化发生机制入手，寻找有效的防治纤维化的方法，是目前医学研究的难点和热点。TGF-β1是目前公认的最重要的促纤维化和EMT的细胞因子，因而通过抑制TGF-β1的产生或阻断其生物活性来抑制EMT，被认为是抗肾纤维化的重要靶点。 肾间质纤维化发病机制之一是氧化应激(oxidative stress)，在输尿管梗阻(ureteral obstruction)性肾病的肾间质纤维化的动物模型中发现抗氧化能力下降;同时也有学者发现，在哺乳动物细胞中，虽然不同的生长因子或细胞因子引发各自的信号转导及细胞反应，但他们的作用几乎均通过活性氧(reactive oxygen species，ROS)这条共同通路来完成，因这些因子可引起细胞内ROS迅速升高;如果抑制ROS生成，则阻断了外界刺激引起的相应的信号转导(Signal pathway)，使细胞增殖(proliferation)等功能受到抑制，因此理论上抗氧化剂对肾间质纤维化有保护作用。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是强抗氧化剂，有研究发现EGCG有抗肝脏和胰腺纤维化的作用，而对于肾脏纤维化和转分化有无影响目前尚无报道。 本研究通过单侧输尿管结扎术制作梗阻性肾病大鼠模型，观察肾小管上皮细胞是否可以发生转分化，并验证EGCG对于肾小管上皮细胞转分化有无抑制作用;通过TGF-β1诱导体外培养的肾小管上皮细胞转分化，探讨肾小管上皮细胞转分化的信号转导途径，并观察EGCG对肾小管上皮细胞转分化的调控作用，为治疗肾纤维化提供新的理论依据和方法。 实验材料与方法: 一、材料 Wistar大鼠由中国医科大学附属盛京医院实验动物中心提供。随机分为3组:正常对照组（N组），UUO模型组（以单侧输尿管结扎制作肾间质纤维化模型），和EGCG治疗组(该组在单侧输尿管结扎术后每日给予腹腔注射EGCG5mg/kg)。在3天，7天和14天处死取材。 大鼠肾小管上皮细胞株(NRK-52E)，购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，由ATCC引进。将培养的细胞随机分为四组: 1组:正常对照组(N)，以DMEM培养液为空白对照。 2组:TGF-β1诱导组（培养液中TGF-β1的浓度为10ng/ml）， 3组:EGCG200ug/ml干预组，培养液中TGF-β1的浓度为10ng/ml，EGCG浓度为200ug/L。 4组:EGCG400ug/ml干预组，培养液中TGF-β1的浓度为10ng/ml，EGCG浓度为400ug/L。 各细胞组在48小时收集细胞待测。同时1，2，3组进行细胞爬片，48小时后多聚甲醛固定后待测。 二、方法 大鼠肾组织一部分经4％的多聚甲醛固定后，用石蜡包埋，切片后用HE染色和Masson染色，观察病理改变。 大鼠肾组织用免疫组化方法检测α-SMA、CK-18、TGF-β1，Wstern-blot法检测细胞核内NF-κB的蛋白表达情况。 各组细胞用免疫组化方法检测细胞爬片α-SMA、CK-18，采用Western-bloting方法检测细胞浆中cyclinD1，MMP9，Pi-Smad3，Pi-ERK，和细胞核中β-catenin的蛋白表达。各组细胞采用Realtime PCR检测上述指标的mRNA的表达。 三、统计学分析 数据以均值±标准差（(x)±S）表示，采用SPSS15.0统计软件进行单因素方差分析，以P＜0.05具有统计学意义。 实验结果: 一、UUO组及EGCG治疗组大鼠肾组织的病理变化 HE染色显示，光镜下正常对照组大鼠肾脏组织结构正常，肾小管排列紧密整齐，未见肾小管扩张、间质炎性细胞浸润及纤维增生等改变;UUO组第14天肾小管结构遭到严重破坏，可见肾小管萎缩，肾小管、集合管扩张呈囊状，管腔塌陷，上皮细胞大量坏死，肾间质弥漫性巨噬细胞、淋巴细胞浸润和成纤维细胞增生。EGCG治疗组14天上述改变较UUO组14天减轻。 Masson染色显示，假手术组肾脏胶原染色主要位于小管基膜，UUO组14天胶原沉积明显增多，肾间质增宽，间质细胞及细胞外基质成分增多，肾间质纤维化程度明显加重，肾间质纤维组织相对面积较正常对照组明显增大。EGCG治疗组14天上述改变较UUO组14天减轻，肾间质纤维组织相对面积较UUO组14天减少。 二、EGCG对UUO大鼠肾组织中CK-18、α-SMA，NF-κB和TGF-β1表达的影响 免疫组化和Western-blot结果显示: CK-18的表达情况:正常对照组肾小管上皮细胞胞浆中高表达，UUO组7天表达明显减少，14天减少更明显;而EGCG治疗组CK-18减少的程度比UUO组轻。 α-SMA的表达情况:正常肾组织肾小管上皮细胞胞浆中几乎不表达，UUO组7天和14天高表达，而EGCG治疗组较UUO组表达减少。 NF-κB表达情况:正常肾组织细胞核内微量表达，UUO组随着时间延长，表达逐渐增多;而EGCG治疗组各时间点较UUO组表达减少。 TGF-β1表达情况:正常组几乎不表达，UUO组7天和14天在肾小管上皮细胞胞浆中高表达;EGCG治疗组各时间点均较UUO组减少。 三、EGCG对TGF-β1诱导的NRK细胞CK-18、α-SMA、cyclinD和MMP9表达的影响 免疫组化和Western-blot结果显示: NRK细胞CK-18、α-SMA蛋白的表达情况:NRK细胞被TGF-β1诱导48小时后，胞浆中CK-18蛋白表达明显减少，α-SMA蛋白出现了高表达;而NRK细胞被TGF-β1和EGCG联合作用48小时后，上述改变减轻。 NRK细胞cyclin D1，MMP9蛋白及其mRNA的表达情况:NRK细胞被TGF-β1诱导48小时后，cyclin D1，MMP9蛋白及其mRNA表达明显升高;而NRK细胞经TGF-β1和EGCG联合作用后，上述改变的程度减轻，并且EGCG浓度为400ug/L时比200ug/L能进一步减轻上述蛋白及mRNA的表达。 四、EGCG对TGF-β1诱导的NRK细胞Pi-Smad3，Pi-ERK1/2，β-catenin及其mRNA的影响 Western-blot结果显示: NRK细胞浆中Pi-Smad3蛋白及Smad3mRNA表达:NRK细胞被TGF-β1诱导48小时后，Pi-Smad3蛋白及Smad3mRNA表达明显升高;而NRK细胞经TGF-β1和EGCG联合作用后，上述改变的程度减轻，并且EGCG浓度为400ug/L时比200ug/L能进一步减轻上述蛋白及mRNA的表达。 NRK细胞浆中Pi-ERK1/2蛋白及ERK2 mRNA表达:NRK细胞被TGF-β1诱导48小时后，Pi-ERK1/2蛋白及ERK2 mRNA表达明显升高;而NRK细胞经TGF-β1和EGCG联合作用后，上述改变的程度减轻，并且EGCG浓度为400ug/L时比200ug/L能进一步减轻上述蛋白及mRNA的表达 NRK细胞核中β-catenin蛋白及其mRNA的表达:TGF-β1诱导组β-catenin蛋白较正常组表达明显升高，EGCG干预组表达少于TGF-β1诱导组，并且EGCG浓度400ug/L比200ug/L时减少更明显;TGF-β1诱导组β-catenin的mRNA的表达较正常组减少，EGCG干预组较TGF-β1诱导组表达增多，但仍少于正常组。 结论: 1、UUO大鼠存在肾小管上皮细胞转分化，EGCG能通过减少TGF-β1的表达和减少NF-κB的活化，维持肾小管上皮细胞表型，减轻肾小管上皮细胞转分化。 2、在体外实验，EGCG以剂量依赖方式抑制MMP9、cyclin D1的表达，通过保护基底膜和抑制细胞增殖减轻肾小管上皮细胞转分化。 3、在体外实验，EGCG以剂量依赖方式抑制ERK、β-catenin和Smad转分化信号通路传导，而减轻肾小管上皮细胞转分化。 4、EGCG具有减轻梗阻性肾病大鼠肾脏纤维化的作用，为抗肾脏纤维化的治疗提供理论依据。