【摘 要】
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结核病(Tuberculosis,TB)是通过结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)感染引发的传染病,威胁人类的生命健康,世界上大约四分之一的人口感染过结核分枝杆菌。患者将细菌排入空气时,会通过气溶胶进行传播,影响身体的多个脏器,其中对肺部的影响最常见。巨噬细胞作为机体免疫系统自主抵抗M.tb感染的起始细胞,在M.tb感染的免疫反应中发挥重要作用,但易被M.
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结核病(Tuberculosis,TB)是通过结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)感染引发的传染病,威胁人类的生命健康,世界上大约四分之一的人口感染过结核分枝杆菌。患者将细菌排入空气时,会通过气溶胶进行传播,影响身体的多个脏器,其中对肺部的影响最常见。巨噬细胞作为机体免疫系统自主抵抗M.tb感染的起始细胞,在M.tb感染的免疫反应中发挥重要作用,但易被M.tb作为细菌繁殖的场所,发生免疫逃逸。现阶段,随着转录组测序的发展,也不断地丰富了对M.tb的研究方式。本研究将整合转录组测序技术(RNA-seq)与生物信息学,分析M.tb H37Rv标准株感染THP-1源性巨噬细胞的m RNA表达谱,进一步筛选出关键基因,旨在为进一步阐释宿主与结核感染以及发病等相关的免疫应答机制提供新思路,同时为结核病诊断及治疗提供新方法。本研究中,我们通过RNA-seq获得了结核分枝杆菌感染巨噬细胞模型的m RNA表达谱,利用DESeq2软件对结果进行标准化分析,筛选出差异表达的基因。应用STRING在线工具,构建差异表达基因的蛋白质—蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络,使用Cytoscape软件中的MCODE插件进一步分析模块并筛选出核心差异基因。对核心基因进行功能注释(GO-Analysis)和信号通路富集分析(Pathway-Analysis)。利用q RT-PCR检测差异基因的表达水平,以确定H37Rv感染组中的关键基因,并对关键基因进行敲降,通过酶联免疫吸附实验(ELISA)和蛋白免疫印迹(Western Blot)等来分析该基因在结核分枝杆菌感染巨噬细胞中的作用。通过对RNA-seq结果进行分析,筛选出1678个差异表达基因,其中1011个基因表达上调,667个基因表达下调。在STRING数据库上建立PPI网络,并使用Cytoscape软件中的MCODE插件进行聚类分析,确定了含有47个差异表达基因的核心模块。运用DAVID和KOBAS对这些基因进行GO和KEGG分析,最终确定了5个差异表达的基因(IRF5、IRF7、EGR1、CREBBP、FOSL1)。利用q RT-PCR检测m RNA中差异基因IRF5、IRF7、EGR1、CREBBP、FOSL1的表达水平,发现与测序结果一致;并且EGR1基因在H37Rv感染组和对照组之间具有显著的表达差异。因此,将EGR1作为关键基因,利用q RT-PCR及ELISA检测EGR1基因敲降情况,结果均表明EGR1基因敲降会抑制炎症因子TNF-α分泌。同时检测了敲降EGR1基因对结核分枝杆菌感染巨噬细胞中Caspase3/9蛋白酶活性的影响,结果表明EGR1基因敲降后细胞中Caspase3/9的蛋白酶活性均显著升高,进而促进细胞凋亡。Western Blot实验验证了6种凋亡蛋白(Bax、Bcl-2、Caspase-3、cleaved-Caspase-3、PARP、cleaved-PARP)表达情况,结果显示,EGR1敲降后除Bcl-2表达下降以外,其余5种蛋白表达均升高,说明EGR1基因敲降会激活细胞内线粒体依赖性途径进而介导细胞凋亡。
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