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以银杏叶为试材,研究叶黄酮生物合成关键酶---苯丙氨酸解氨酶(PAL)的特性及主要影响因子,并开展了提高银杏叶黄酮含量试验。主要结果如下: 1、分离纯化及基本性质 经过一系列的分离纯化,蛋白质得率为0.35,酶的得率为1.17,纯化倍数为3.32。PAL在硼酸缓冲液中最适pH是8.8,在Tris-HCl缓冲液中最适pH为:pH8.0、pH8.8。用pH10和pH4 Tris-HCl处理,5 min后,PAL活性分别残存13.07%,45.64%。PAL最适反应温度为50℃,该酶较耐高温:40℃,50℃水浴30 min,60℃,70℃,80℃水浴20min,90℃水浴10 min,100℃水浴5 min时,酶活性还残存50%左右。酶液酶活性残存50%左右时,贮存时间长短依次为:-20℃甘油贮存液:37d、-20℃40%(NH4)2SO4悬浮液:21d、-20℃上清液:15d、4℃甘油贮存液:21 d、4℃上清液:5 d、4℃ 40%(NH4)2SO4悬浮液:3d。PAL最适底物浓度为0.02mol/L,其Km为8.568×10-3mol/L。 2、金属离子对酶活性的影响 重金属BaCl2、SrCl2、Co(NO3)2都能不同程度地抑制酶活性,而4 mmol/LAgNO3能够增加酶活性,其余轻微地抑制酶活性;活性中心常见金属离子FeSO4、CuSO4、Zn(Ac)2、MnSO4和ZnSO4能大幅度地促进酶活性,最佳促进效果为:FeSO4>CuSO4>Zn(AC)2>MnSO4>ZnsO4,最佳处理浓度为FeSO4 4mmol/L,CuSO4 4mmol/L,Zn(AC)2 0.05mmol/L,ZnSO4 4mmol/L,MnSO4 2mmol/L。不同浓度的Al2(SO4)3、CaCl2、MgCl2对酶活性的影响效果不明显。4 mmol/L,0.5 mmol/L EDTA抑制酶活性,2 mmol/L,1 mmol/L EDTA促进酶活性,4 mmol/L,0.5 mmol/L KHB4轻微促进酶活性,2 mmol/L,1 mmol/L KHB4强烈抑制酶活性。 3、光及机械损伤对酶活性的影响 室温下,PAL活性在黑暗条件下缓慢降低;红光,白光以及机械损伤均能使PAL活性升高,在红光、白光下,PAL活性呈周期性变化,其周期约为24h,其中白光的作用效果优于红光。机械损伤使PAL活性快速上升后急剧下降,最后再缓慢下降,没有表现节律性。低温下的光照试验结果与室温下的相同。 4、生长调节剂对离体叶片酶活性的影响 各种措施的诱导效果为:ETH>2,4-D>IAA>ABA>GA3。ETH处理都不同程度的诱导酶活性,其中300 mg/LETH诱导作用最强;CCC处理均能诱导酶活性上升,但随着其浓度的升高,诱导能力下降,200 mg/L诱导作用最强。ABA除了100 mg/L处理使酶活性略有降低外,其他三个浓度的ABA都能诱导酶活性升高,75 mg/L ABA诱导能力最强。IAA除了100 mg/L酶活性比CK低外,其它三个浓度都比CK酶活性要高,诱导作用最强的是70mg/L,且诱导全过程的酶活性都比CK高。2,4-D处理都能诱导酶活性,其中40 mg/L2,4-D诱导效果最强,40 mg/L 2,4-D处理有两个明显的诱导高峰。GA3的四个浓度处理中仅75 mg/L能使酶活性比CK高。刘卫红:银杏叶苯丙氨酸解氨酶特性及其对叶黄酮含量调控的研究 5、底物、末端产物对离体叶片酶活性的影响 苯丙氨酸处理浓度高于2.5 Inlnol/’L时,抑制酶活性,从2.5 Inlnol/L开始促进酶活性,诱导活性最强的是1.25二。1/L。4个浓度的反式肉桂酸处理都能抑制酶活性,IOOmg毛反式肉桂酸抑制酶活性作用最大。3,5一DHCA除100 mg/L微弱地增加酶活性外,其余都抑制酶活性,抑制酶活性最强的为200 mg/L。阿魏酸除100 mg/L浓度增加酶活性外,其他浓度都降低酶活性,50 mg/L抑制酶活性最强。4个浓度的4,5,7一三轻黄烷酮(、aringenin)都能抑制酶活性,其中,6.25mg/L抑制能力最强,6.25 mg/L Naringenin抑制有3个高峰,分别出现在15 min,4h,12h。. 6、盆栽园和叶用园各处理对PAL活性及黄酮含量的影响 盆栽园和叶用园银杏苗CK中叶黄酮含量变化均有3个明显的峰,两个分别出现在8一03,11一03,另一个峰盆栽园出现在9一19,而叶用园出现在9一03。叶用园CK酶活性变化和黄酮变化同步,盆栽CK酶活性只有两个峰值,出现在8一03,10一03,和黄酮含量变化前期(10一3前)同步,后期(10一3后)不同步。 盆栽园:4种金属离子处理,酶活性以及黄酮含量均比cK大,0.1%、0.3%FeS认 (浓度I、浓度1 11),0.1%ZnSO4(浓度I)、0.1%、0.5%MnSO;(浓度I、浓度111),0.4%CuSO;(浓度HI),处理不仅提高叶黄酮含量,而且还延长了最佳采叶期。提高黄酮含量最佳浓度组合为0.2%ZnSO4,0.3%MnSO4,0.4%Cuso4,0.1%FeSO;,其黄酮含量(1 .6194%)远远大于其它处理。黄酮含量变化峰值和酶活性变化峰值不一致。 叶用园:ETH、CCC、2,4一D、IAA、GA3、SA、Phe各浓度处理黄酮最高含量多出现在8一03至9一03之间,最大酶活性多出现在9一。3至10一03之间。在l卜03,酶活性和黄酮含量增加量都最大的一致处理是:50m罗‘L ccc,70m乡L工AA,400 mgLETH浓度。ETH、ccc、2,4一。、工AA、GA3、S八、阶e各浓度处理酶活性增量和黄酮含量增量均有2个峰值:分别出现在阶旧至9一19间,和9一19至10一19间。酶活性在9一03都比CK大,但黄酮含量反而都比CK小,相差在0.2%以内。