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社会老龄化严重,生存压力、环境污染和食品安全等问题严重影响健康,使衰老症状提前到来,衰老相关疾病发病率随之提高。衰老伴随体内活性氧增多和抗氧化物质减少,氧化还原失衡;抗氧化剂可以通过对抗自由基来减轻机体氧化损伤。纳米材料的多学科交叉应用受到重视,CeO2NPs细胞渗透性强,生物相容性好,晶体表面Ce4+/Ce3+之间的快速可逆转变使其具有可再生的SOD、CAT等多种拟酶活性,有很强的再生抗氧化功能,利用CeO2NPs成功延缓器官衰老和对抗衰老疾病的研究已有报道,但仍需深入研究。本研究以D-半乳糖致衰的TM3/TM4细胞和小鼠为模型,分别从细胞和动物水平研究CeO2NPs对睾丸衰老的保护作用,为CeO2NPs的生物应用提供研究基础。1.CeO2NPs对D-半乳糖诱导的TM3/TM4细胞衰老的影响不同浓度D-半乳糖处理细胞,分别处理24、48及72h,筛选出最佳处理浓度与处理时间。在此基础上,细胞分为4组:①对照组(Control):普通培养基培养 72h;②CeO2NPs 对照组(CeO2NPs):CeO2NPs(10μg/mL)处理 72h;③衰老模型组(D-Gal):D-Gal(150mM)处理72h;④CeO2NPs干预组(D-Gal+CeO2NPs):培养基中加入 D-Gal(150mM)和 CeO2NPs(10μg/mL)处理72h。试验结束后,检测细胞形态、细胞周期、细胞凋亡率、β-半乳糖酐酶活性、ROS浓度、线粒体膜电位、氧化还原指标的变化;ELISA检测TM3细胞睾酮分泌情况;qPCR检测细胞衰老相关基因(P16、P21、P53)、TM3细胞睾酮合成相关酶(StAR、P450scc)、TM4细胞分泌的细胞因子(GDNF、BMP4、SCF)的转录情况;Western blot检测细胞自噬相关蛋白(Beclin-1、P62、mTOR、LC3)的表达情况。主要研究结果如下:(1)成功构建D-半乳糖诱导的TM3/TM4细胞衰老模型。与对照组相比,D-半乳糖(150 mM)处理TM3细胞72h后,细胞活性显著下降(P<0.01),β-半乳糖酐酶活性显著增强(P<0.01),衰老相关蛋白表达显著上调(P<0.01)并伴随细胞周期阻滞。TM4细胞研究结果类似。(2)CeO2NPs可拮抗D-半乳糖的致衰作用,改善模型细胞的衰老表型。与衰老模型组相比,CeO2NPs干预组细胞形态得到改善,细胞ROS含量(P<0.01)、凋亡率(P<0.01)及SA-β-Gal阳性率(P<0.05)均降低,细胞线粒体膜电位(P<0.05)、抗氧化水平(P<0.05)、自噬水平(P<0.05)、TM3细胞睾酮合成酶的转录水平(P<0.05)、TM3细胞睾酮分泌水平(P<0.05)均升高。同时,TM3细胞的G1期细胞阻滞现象得到改善(P<0.05)。此外,CeO2NPs干预后,TM4细胞分泌的GDNF、BMP4、SCF等细胞因子转录水平增高(P<0.05);TM4细胞的G2/M期细胞阻滞现象得到改善(P<0.05)。2.CeO2NPs对D-半乳糖致衰小鼠睾丸退行性变化的影响BALB/c雄性小鼠40只随机分为4组,每组10只,分别为:①对照组(Control):小鼠皮下注射生理盐水,连续56 d;②CeO2NPs对照组(CeO2NPs):小鼠皮下注射生理盐水,连续56天,第16 d开始尾静脉注射CeO2NPs(10μg/kg,每周两次,持续两周);③衰老模型组(D-Gal):小鼠颈背部皮下注射D-Gal(200 mg/kg/d,连续56天;④CeO2NPs干预组(D-Gal+CeO2NPs):小鼠颈背部皮下注射D-Gal(200mg/kg/d),连续56d,第16d开始尾静脉注射CeO2NPs(10μg/kg,每周两次,持续两周)。建模期间观察小鼠生物学动态变化,试验结束后检测小鼠睾丸指数、血清睾酮水平、睾丸组织结构的变化;检测小鼠睾丸β-半乳糖酐酶活性、氧化还原指标(SOD、MDA、GSH-Px)和附睾精子品质的变化;qPCR检测小鼠睾丸中睾酮合成相关酶(StAR、P450scc)、GDNF、BMP4、SCF的转录水平;Western blot检测小鼠睾丸衰老相关蛋白(P16、P21、P53)和自噬相关蛋白(Beclin-1、P62、mTOR、LC3)表达的变化。结果显示:CeO2NPs干预组与衰老模型组相比,小鼠睾丸β-半乳糖酐酶活性显著降低(P<0.01);SOD、GSH-Px抗氧化酶活性提高明显(P<0.05),MDA含量明显减少(P<0.05);附睾精子品质显著提升(P<0.05);睾酮合成相关酶(StAR、P450scc)及细胞因子(GDNF、BMP4、SCF)转录水平均显著提高(P<0.05);小鼠睾丸衰老相关蛋白表达水平降低(P<0.05);自噬水平上调显著(P<0.01)。综上所述,CeO2NPs可以通过清除ROS提高睾丸细胞抗氧化能力和自噬水平,促进睾丸细胞增殖和自我更新,维持睾丸细胞稳态,从而抑制睾丸细胞衰老,改善睾丸结构和功能退行性变化。