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顺式环氧琥珀酸水解酶(cis-epoxysuccinate hydrolase, CESH),是一种水解酶,能催化顺式环氧琥珀酸水解为酒石酸。酒石酸广泛应用于食品、医药、化工、纺织、电镀等行业,其需求量正在逐年递增,目前利用具有立体选择特异性的微生物来源CESH生产酒石酸已逐步成为酒石酸生产技术的新发展方向。本文概述了酒石酸和CESH的研究进展,并研究了新颖水解酶CESH的催化机制及其高效催化工艺。从田园土中筛选到一株产新颖CESH的野生菌,它能将顺式环氧琥珀酸立体特异性的转化为D(-)-酒石酸,经鉴定为博德特氏菌属(Bordetella),并命名为Bordetella sp. BK-52。对该野生菌产酶条件进行优化,最高酶活达764U/g。随后我们从该野生菌中分离纯化得到CESH,酶学性质研究显示,该酶具有温度稳定性好、pH稳定性范围广、金属离子耐受性好,立体特异性高等特点,表明该酶很适合作为工业生物催化剂。此外,我们还首次获得Bordetella sp. CESH的基因序列(GenBank登录号为EU053208)。根据上述CESH基因序列,构建基因工程菌,通过响应面法优化了CESH在大肠杆菌中的表达条件,使工程菌的酶活达到40129U/g,为野生菌的53倍。随后从12种细胞固定化方法中筛选到K-卡拉胶包埋法,通过响应面法优化其固定化条件,使固定化工程菌细胞的酶活回收率达83%。该固定化细胞对温度、pH、金属离子、表面活性剂等多种外界条件具有较强的稳定性,连续使用10批后,残余活力仍为93%,显示出良好的工业应用潜能与前景。红球菌(Rhodococcus opacus) CESH可催化顺式环氧琥珀酸生成L(+)-酒石酸。序列比对和二级结构预测分析显示,该CESH属于卤烷基脱卤酶超家族成员,29个保守位点的定点突变实验、圆二色谱分析、立体特异性分析和酶学性质分析证实,下列9个氨基酸在该酶催化过程中起重要作用：Aspl8、Aspl93、Arg55、Lysl64、Hisl90、Thr22、Tyrl70、Asnl34和Alal88。同位素H218O标记的单转化和多转化实验表明,在水解过程中,水分子中的O原子首先转移到酶中,然后再转移到产物中。接着预测了Rhodococcus opacus CESH的三维结构,整体三维结构和重要活性位点的重叠结果显示,该酶与一些三维结构已知的卤烷基脱卤酶(Hdl、L-DEX和Dh1B)的结构非常相似,采用两步法的催化机制,并推测该催化机制通过催化三联体Asp18-His190-Asp193进行,即CESH中的Asp18首先亲核进攻底物顺式环氧琥珀酸,形成“底物-酶酯中间体”,接着位于活性位点的His190和Asp193激活水分子,进一步水解酯键,并释放产物L(+)-酒石酸。